《Cells》：Diabetic Immunotherapy Advances with BCG: Metabolic and Immune Reprogramming
本综述阐述了多剂量卡介苗（bacille Calmette-Guérin，BCG）作为研究性免疫疗法在自身免疫性糖尿病血糖改善中涉及的细胞和分子机制。BCG相关数据主要来自过去15年的人体临床试验，并结合机制性见解。作为一种疫苗，BCG在全球肺结核预防方面拥有长达一个世纪的安全记录，且36年来已获FDA批准以较高剂量用于膀胱癌治疗。本课题组及其他团队已开展多项临床试验，评估多剂量BCG免疫疗法在两种长期自身免疫性糖尿病成人患者中的应用。在1型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）中，多剂量BCG临床试验显示，FDA推荐的生物标志物糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）可持续重复降至接近正常水平（与安慰剂相比），并维持至少8年。矛盾的是，这种改善并非通过从可忽略的基线水平恢复胰腺功能实现。长期试验证据及配套的全球机制研究表明，血糖改善与BCG诱导的淋巴系和髓系细胞有氧糖酵解缺陷纠正相关，这一结果也见于BCG近亲结核病的肉芽肿中。糖尿病淋巴样细胞能量代谢恢复为有氧糖酵解可增加葡萄糖利用，从而增强机体从血液中的葡萄糖摄取，纵向PET/CT成像证实了这一点。相比之下，成人隐匿性自身免疫性糖尿病（latent autoimmune diabetes in adults，LADA）——一种发生于成年后期的缓慢自身免疫性糖尿病——其临床上显著的有氧糖酵解缺陷轻微或缺失。基于8年数据，在LADA患者中，多剂量BCG免疫疗法通常不出现BCG治疗者常见的血糖改善。然而，LADA仍表现出其他有利的免疫和临床反应，提示BCG诱导调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）产生。在LADA中，多剂量BCG可减轻炎症，从而阻止胰腺自身免疫并挽救胰岛素分泌，同时还可阻止炎症驱动的胰岛素抵抗。BCG在自身免疫性糖尿病中的持续临床获益，与涉及代谢和T细胞通路基因的上游表观遗传重编程的渐进节奏相吻合，且不改变基因型。理解BCG诱导的表观遗传变化与临床疗效之间的机制链条，可能为自身免疫性糖尿病的治疗和潜在预防提供见解。
1. BCG作为免疫疗法的引言
卡介苗（BCG）疫苗虽然古老，但并不过时。自1923年起在全球用于结核病预防的同时，它还具有多种现代应用：作为FDA批准的用于非肌层浸润性膀胱癌的免疫疗法，以及高危结核暴露后的预防干预。BCG也是一种研究性干预手段，用于多种疾病，即所谓的“脱靶”效应，包括多发性硬化、儿童湿疹和过敏、COVID及其他感染性疾病、阿尔茨海默病，以及本综述关注的自身免疫性糖尿病（1型糖尿病和成人隐匿性自身免疫性糖尿病）。
与大多数其他针对自身免疫性糖尿病的免疫疗法（这些疗法均为免疫抑制剂，因而具有显著不良效应）不同，BCG具有可靠的安全记录，并且是首个正在研究用于多种自身免疫疾病（如自身免疫性多发性硬化）的免疫刺激剂。其免疫刺激特性包括激活的固有免疫细胞释放细胞因子、增强抗原呈递，以及诱导急性训练免疫（一种由固有免疫细胞实现的“记忆”形式）。在固有训练免疫中，固有免疫细胞一旦被BCG感染，便获得类似记忆的特征：在再次受到类似刺激时表现出增强的细胞因子释放，这一过程由BCG诱导的甲基化改变所驱动的组蛋白变化介导。急性固有免疫训练之后，免疫系统所有细胞区室（T细胞、B细胞、单核细胞）中会发生慢性适应性免疫训练，这一较慢的过程不涉及组蛋白，而是直接对基因通路进行表观遗传重塑，如T细胞受体内的基因、抑制性Treg细胞的激活，以及涉及葡萄糖利用的代谢通路（如有氧糖酵解）的重新布线。BCG是牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）的非致病性菌株，该菌是牛结核病的病原体，不感染人类。牛分枝杆菌之所以能作为结核病疫苗，是因为它类似于人类结核病的病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）。类似地，结核分枝杆菌也利用表观遗传机制在宿主中长期生存，例如诱导Treg细胞，显示出这两种古老生物在宿主相互作用中的重叠性。
BCG在人体、动物模型和细胞培养中利用表观遗传的能力已有大量文献记录，过去10年相关论文超过8000篇，通常称为固有免疫训练。同样，BCG通过表观遗传塑造适应性免疫系统（一种在体内也观察到的较慢免疫反应）的能力，也是科学文献中深入研究的主题，称为适应性免疫训练。在本综述中，这两种BCG塑造免疫系统的机制仅在糖尿病人体研究的背景下提及，其中在某些情况下将强调糖尿病的潜在异常，以使BCG诱导的表观遗传建模能够产生理想的治疗结果。
本综述的目标是检查BCG在T1D或LADA（仅有的两种自身免疫性糖尿病）中显示血糖改善和/或疾病改善效应的细胞和分子机制。我们描述了BCG对免疫代谢和Treg激活作用的证据，随后介绍了表观遗传驱动因子的上游作用。表观遗传驱动效应既有急性发生，也会在1–3年内逐步展开，这与临床结局的延迟出现相一致。最后，我们考虑了这些机制见解如何为正在进行的自身免疫疾病治疗和预防工作提供信息，并为BCG免疫疗法在其他炎症性疾病（如阿尔茨海默病）中的获益提供见解。
2. BCG临床试验显示对自身免疫性糖尿病的多重获益
我们已完成五项多剂量BCG免疫疗法用于成人长期T1D血糖改善的人体临床试验。两项大型双盲临床试验正在儿童糖尿病受试者中进行，观察血糖结局。其中一项试验（2期，5–8年）增加了成人隐匿性自身免疫性糖尿病（LADA）研究人群，其定义为发病年龄≥21岁。在这些研究中，LADA还通过存在自身抗体（最常见为GAD）、胰腺C肽分泌缓慢下降以及发病年龄较大来识别。T1D定义为发病年龄<21岁。五项试验中有两项为开放标签前瞻性研究。五项试验中，入组时病程从>1年至成年不等。四项试验发现BCG显著改善T1D的血糖控制。一个反例是第一项试验（1A期），回顾来看，其随访时间过短（20周）。另一个反例是LADA 2期8年试验。LADA在5年观察期内未显示血糖改善，但确实阻止了胰岛素抵抗，并部分停止和恢复了胰腺胰岛素分泌，证实自身免疫被消除。这两个重要的临床观察可能都与BCG诱导的Treg减少炎症有关。LADA在5年内未能显示血糖改善，支持了我们关于BCG作用机制的证据体系，包括在入组时纠正潜在的糖代谢缺陷（见后续部分）。包括与BCG其他脱靶效应相关的糖尿病试验结局，如免受COVID-19感染、免受所有感染性疾病、免受阿尔茨海默病，共研究了1140多名已同意的1型糖尿病受试者。
更具体地说，接受最多六剂BCG免疫治疗的T1D患者在2–3年后被发现HbA1c水平稳定降低约7–15%（与安慰剂或基线相比），并持续至8年随访结束。根据一项备受推崇的研究，改善幅度在微血管并发症风险降低方面具有临床意义。该研究还首次表明，BCG治疗的长期糖尿病患者可长期恢复血糖正常，血糖正常范围为70–99%，而非高血糖范围。在我们的2期试验中，我们发现5年中HbA1c降幅最大，在发病年龄最早（<12岁）的成人参与者中接近19%，这一发现与有氧糖酵解缺陷的程度相关。与胰岛素不同，即使通过新型CGM和胰岛素泵技术进行精细控制，BCG也不诱导低血糖，并且比胰岛素泵或持续葡萄糖监测（CGM）设备的标准治疗显示出更严格的血糖控制。虽然不是我们研究的主要结局，但在第8年，41%的长期1型糖尿病受试者HbA1c值处于正常范围（低于5.8 mg%），且低血糖发生率未增加。
多剂量BCG在所有试验中均被证明是安全的，没有出现治疗相关的中度或重度全身不良事件。临床试验证据得到多项回顾性或生态学研究的支持，这些研究表明，既往新生儿期接种BCG用于结核病预防，与多年后T1D血糖控制改善或T1D发病率降低相关。既往高剂量BCG膀胱灌注治疗膀胱癌与T1D（而非2型糖尿病）患者随后HbA1c改善相关。
LADA结果。唯一一项对LADA（发病年龄≥21岁）进行了充分随访（5–8年）的BCG临床试验发现，在该时间范围内HbA1c无改善。尽管如此，BCG对LADA确实有其他临床意义的获益；即阻止胰岛素抵抗、停止胰岛细胞丢失（以C肽衡量），以及减少活动性自身免疫。这些发现对于理解BCG对免疫代谢和Treg细胞的作用具有机制重要性，两者均将在后续讨论。
3. BCG反应的非同寻常的时间与临床特征
我们深入研究BCG分子和细胞机制的动因来自临床试验中遇到的至少三个非同寻常或意外的特征。第一个是血糖改善开始前有2–3年的延迟。事实上，在第一项为期20周的试验（1A期RCT）之后，我们过早地得出结论，即尽管生物标志物结果有利，但BCG与血糖获益无关。几年后，我们了解到一项将BCG用作免疫疗法的多发性硬化试验，该试验显示在3–5年延迟后出现临床获益。因此，我们随后进行了一项1B期试验，延长随访至第8年。1B期结果表明延长是值得的：到第4年，我们通过连续血液采样成功显示HbA1c较基线累计下降18%。许多免疫疗法，在有限剂量下，需要数年才能显示获益，包括免疫重建疗法、过继细胞疗法、免疫检查点抑制剂和基因疗法，更不用说其他疫苗了。
另一个特征是在有限剂量后数年血糖改善仍持续存在。两项RCT显示，BCG获益至少持续8年。这一特征得到后续机制证据的支持，也得到关于新生儿BCG获益的RCT证据的支持。一个显著的例子是新生儿BCG用于结核病预防的RCT：获益在60年后仍可测量。在晚期随访中，作者报告“疗效仅略有下降，但无统计学意义”。没有其他BCG治疗T1D的RCT，更不用说关于东京BCG菌株（最强效多剂量频率）的观察性研究。这使得大多数关于新生儿BCG对T1D影响的观察性研究不适用，除非有生物标志物变化的支持。
我们在启动BCG临床试验前的假设是，基于NOD模型的结果，人类会显示胰腺恢复或再生。相反，对于发病年龄较早的1型糖尿病患者，在我们针对早发型1型糖尿病成人的试验中，尽管存在长期HbA1c改善的一致证据，但没有明显胰腺恢复的证据。相比之下，LADA患者胰腺中非常活跃的自身免疫——这种疾病状态保留了更多基线胰腺功能——显示出疾病停止和刺激后C肽恢复。当然，这些长期1型糖尿病受试者从儿童期起就患有糖尿病，试验开始时平均病程超过15年，因此通过胰高血糖素刺激，胰腺胰岛素分泌细胞在功能上被证明在试验开始时不存在，BCG免疫治疗后也不存在，但HbA1c如何稳定下降？这一悖论将我们的研究转向非胰腺机制。
4. BCG在T1D中血糖改善的机制
BCG改变免疫代谢
所有测量C肽的BCG临床试验均未发现变化。我们为期20周的1A期BCG试验显示，C肽在可忽略的基线水平上出现短暂但非持续的改善。下一项试验，1B期，显示在8年随访中同样没有C肽恢复，尽管血糖显著改善至接近正常水平。
血糖改善而无胰腺恢复的悖论促使我们使用多种方法并在多个分析层面研究非胰腺机制：系统水平（代谢组学）、细胞水平（定量葡萄糖摄取测定）、器官水平（纵向PET/CT成像）和基因水平分析（通过mRNA-seq进行转录谱分析；通过BeadChip阵列进行DNA甲基化谱分析）。
基于微生物重编程免疫细胞代谢的众所周知观察，1B期通过代谢组学和mRNAseq评估了BCG（与安慰剂相比）受试者的代谢变化。研究发现BCG触发T细胞（和单核细胞）代谢的转变。该转变从过度依赖三羧酸循环和氧化磷酸化（一种低葡萄糖利用状态）转向有氧糖酵解（一种高葡萄糖利用状态）。有氧糖酵解（也称为Warburg效应）是指在有氧条件下也能快速分解葡萄糖以产生ATP，通常被激活的免疫细胞用来快速增殖。
在寻找证据过程中，1B期试验分析了血液中随时间变化的690种代谢物。该RCT报告BCG受试者中葡萄糖加工代谢物水平更高，与血液葡萄糖摄取和利用增加一致。这包括更高水平的嘌呤合成中间体。在基因表达测定中，该试验发现控制磷酸戊糖途径的蛋白质表达上调，该途径在糖酵解早期分支，为嘌呤生物合成提供核糖-5-磷酸。与氧化磷酸化不同，有氧糖酵解驱动磷酸戊糖途径的通量增加，从而增强免疫细胞活化和快速增殖所需的嘌呤生物合成。
mRNAseq分析进一步支持了代谢组学所见到的全身性有氧糖酵解转变。在基线时，T1D淋巴细胞上调OXPHOS相关基因并下调糖酵解相关基因。BCG组（与安慰剂相比）显示葡萄糖转运蛋白和早期糖酵解酶（HK2、PFKFB3）表达上调，而晚期糖酵解酶表达下调。这表明BCG并非简单“打开”所有糖酵解中间步骤，而是选择性加速受调控的葡萄糖进入淋巴系统。最后一块拼图来自代谢组学发现：BCG受试者血清乳酸和丙酮酸水平较高，这是向有氧糖酵解代谢转变的经典全身性指标。
随后三项研究确认或扩展了对有氧糖酵解转变的理解。一项为期2年的BCG开放标签试验复现了使用另一种BCG菌株（东京株对比早期赛诺菲株）时细胞葡萄糖摄取增加的结果，并通过体外葡萄糖摄取和利用测定法2-NBDG（一种荧光标记的葡萄糖类似物）量化了摄取程度。摄取量还复现了1B期试验中发现的HbA1c降低幅度和时间过程。在研究来自LADA另一组患者的细胞时，通过定量2-NBDG测定未发现基线单核细胞或淋巴细胞葡萄糖摄取缺陷。T1D与LADA之间的这种差异后来在体内5年2期RCT中复现：LADA参与者在BCG后5年观察期内未显示HbA1c降低，而T1D参与者确实显示降低。
通过mRNAseq，我们展示了在T1D患者CD4 T细胞和单核细胞中，BCG在56周内上调mTOR转录。MYC的上调作为改善葡萄糖代谢的中心开关，因为BCG还激活了近二十多个MYC靶基因，影响四条代谢通路，包括有氧糖酵解，从而加速细胞外葡萄糖的利用。这四条通路提供能量以支持免疫细胞增殖和激活。增强的增殖和激活也代表了在子细胞中放大代谢重编程的一种方式。
脾脏的作用。所有关于BCG诱导从OXPHOS转向有氧糖酵解高葡萄糖利用状态的发现，最终在一项为期3年的开放标签试验中达到高潮，该试验通过纵向PET/CT成像研究BCG对葡萄糖调节的影响。PET/CT成像旨在纵向绘制葡萄糖类似物18F-氟脱氧葡萄糖（18F-FDG）摄取的器官特异性变化。该试验没有安慰剂组，因为让安慰剂组暴露于重复成像程序而不提供任何潜在获益将是不道德的。与所有既往长期试验一样，Dias及其同事的研究发现HbA1c随时间显著下降。
该试验发现，相对于基线，18F-FDG摄取最大增加发生在脾脏。在第2年，脾脏标准化摄取值比（SUVR）较基线增加47%，而其他器官均未随时间显著增加，甚至没有接近相同幅度。脾脏葡萄糖摄取的显著增加与HbA1c降低的开始时间一致。研究者还在BALB/c小鼠中进行了实验研究，通过菌落检测评估BCG给药后的细菌分布。BCG菌落在脾脏中最为丰富，在肝脏和骨髓中检测到较低水平。基于这些发现，作者得出结论，脾脏拥有大量淋巴细胞和单核细胞，成为BCG在T1D中介导降糖效应的主要身体部位。
脾脏在葡萄糖调节中的潜在作用还得到观察性研究的支持，这些研究报告了脾切除术后长期的糖尿病相关结局。与匹配对照相比，脾切除患者数年后持续表现出较高的血糖水平，以及根据两项涉及数千名参与者的全国性人群队列研究，新发糖尿病的风险高2.0至2.35倍。
5. 表观遗传调节驱动的免疫代谢转变
我们人体试验的证据共同表明，BCG逐渐将免疫代谢从过度依赖OXPHOS转向有氧糖酵解。首剂后3年，脾脏成为BCG驱动有氧糖酵解转变的身体部位。脾脏的大量淋巴细胞可以解释全身性HbA1c降低。这就引出了一个问题：是什么控制向有氧糖酵解的转变？
上游关键由表观遗传分析提供。表观遗传学是研究BCG因果链上游触发因素的合理选择，因为已知细菌具有表观遗传修饰宿主DNA的能力。表观遗传学（通过DNA甲基化变化）是一个持久的过程，并通过细胞分裂遗传。表观遗传学可能提供一种机制，通过该机制，有限的BCG剂量可以诱导我们所观察到的长期持久的免疫系统转变。
因此，Dias及其同事试图确定表观遗传学是否在淋巴样代谢重编程中发挥作用。使用CD4+ T细胞基因组DNA的甲基化珠芯片，研究发现，在基线时，T1D患者过表达两个直接或间接抑制糖酵解的关键基因。相对于对照，两个基因的启动子CpG位点均呈低甲基化（过表达）。
第一个是KDM2B基因，它修饰组蛋白并抑制基因功能。该基因携带的CpG位点此前在2型糖尿病表观基因组关联研究中被发现异常甲基化。在T1D患者中，BCG在3年期间逐渐将KDM2B重新甲基化，从而降低其表达。通过mRNAseq，团队证实随着时间推移mRNA转录越来越少。组蛋白去甲基化酶基因的抑制或沉默具有依赖于情境的效应，具体取决于细胞类型等因素。在T1D激活免疫细胞的背景下，KDM2B沉默被认为使染色质转变为更转录激活的状态。转而，这被认为会增加糖酵解，可能是通过早先BCG驱动和MYC激活的代谢程序。总之，KDM2B抑制是由BCG在DNA水平施加的上游表观遗传调节所诱导，但功能后果通过组蛋白调节发生。
另一个感兴趣的基因DDIT4在T1D CD4 T细胞的CpG位点基线时也较对照低甲基化。使用相同方法，发现BCG暴露可将这些CpG位点重新甲基化。该基因的再甲基化降低其表达，如mRNAseq所确认。由于DDIT4是调节酶mTOR的已知抑制剂，基因抑制会增加DDIT4活性。mTOR控制葡萄糖摄取、糖酵解以及与生长相关的其他细胞功能。
已知更高的mTOR活性主要通过mTORC1途径提高MYC mRNA翻译为蛋白质的效率，并通过mTORC2信号增强MYC稳定性，从而促进MYC表达和功能。虽然这项BCG研究或MYC研究均未直接证明BCG驱动的表观遗传学触发的信号级联，但这些结果在生物学上与以下模型一致：BCG增强长期mTOR信号传导，进而支持MYC驱动的免疫细胞代谢重编程。
6. BCG诱导免疫抑制性Tregs
调节性T细胞（Tregs）是免疫抑制细胞，约占外周CD4+ T细胞的5–10%。Tregs维持免疫自我耐受和免疫稳态。它们表达谱系定义转录因子FOXP3、高水平的CD25（IL-2受体α链）和组成性CTLA-4，以及其他关键标志。有充分证据表明，Tregs通过多种机制保护胰腺β胰岛细胞：抑制胰岛素自身反应性效应T细胞、调节抗原呈递细胞功能、抑制促炎细胞因子产生以及限制胰岛炎症等。Treg功能受损——以及在某些个体中Treg数量或激活状态减少——导致免疫耐受破坏和T1D发病机制。
我们的1A期试验显示，BCG治疗在急性基础上增加了BCG治疗受试者循环Treg数量（与匹配的健康对照相比），而安慰剂治疗受试者保持稳定。在20周试验期间，BCG组通过累积Treg比率（患者与对照）显示出更高的曲线下面积。BCG对Treg的急性影响是由其诱导感染单核细胞和其他固有免疫细胞释放肿瘤坏死因子（TNF）所介导。TNF通过其肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）信号传导诱导Treg，TNFR2在强效Treg上高表达。Treg诱导与选择性消除大多数自身反应性T细胞（也通过TNF诱导）相结合，导致部分内源性胰岛素产生的短暂恢复。但这种短暂改善不足以转化为HbA1c降低，如前所述。
更长时程的BCG诱导Treg研究是更广泛表观遗传分析的一部分。值得注意的是，该研究提供了为期3年的纵向分析。它报告了Treg中基线甲基化缺陷，随后是BCG诱导的Treg（与HbA1c水平相关）。在基线时，T1D患者FOXP3基因过度甲基化。这一发现提示存在诱导稳定Treg的表观遗传屏障。BCG免疫治疗与Treg特征基因从约第1年开始逐渐去甲基化相关。在早发型T1D（<20岁）中，BCG诱导的Foxp3基因去甲基化速度在第1–2年快于晚发型（>20岁），大致对应于T1D与LADA。然而，到第3年，两种自身免疫性糖尿病组均达到相同的去甲基化水平。
自身免疫性糖尿病中的Treg更可能是未成熟CD45RA+ Treg，意味着它们具有静息或初始表型。在体外抑制试验中，CD45RA+ Treg比CD45RO+ Treg抑制性更弱。BCG治疗与第1年CD45基因的早期去甲基化相关，此后去甲基化缓慢增加至第3年。去甲基化在时间上与CD45RA初始Treg向CD45RO成熟Treg转变的发现相关（通过纵向流式细胞术和抗体表型分析）。Treg上的CD45RA标志物通过平均荧光强度评估，在BCG组中逐渐丢失，而安慰剂（未接受BCG治疗的受试者）中相同标志物不随时间下降。总之，BCG受试者显示Treg在体内1–3年内扩增（基于流式细胞术），且扩增与血糖改善的HbA1c降低时间相关。
7. BCG驱动的Treg表观遗传调节
为期8年的1B期试验包括一项研究，通过BeadChip技术评估六个Treg特征基因的DNA甲基化状态，以确定BCG是否能持久重置Treg。BCG暴露后早在第8周，这些基因内的数十个CpG位点与基线相比表现出显著的DNA去甲基化。由于DNA去甲基化预期会增加基因转录，该研究发现相同Treg特征基因的mRNA表达上调（通过mRNAseq测量）。问题是这种去甲基化是早期TNF驱动的Treg诱导（通过短期急性免疫记忆）的一部分，还是一种长期持久的Treg诱导形式？
长期Treg甲基化变化在一项为期3年的纵向开放标签研究中得到研究，该研究针对长期自身免疫性糖尿病使用BCG。这项表观遗传研究的重点是最强效抑制能力的Treg亚群。使用EPIC BeadChip（可查询基因组中850,000个CpG位点），该研究检查了11个Treg特征基因的甲基化变化，以及对FOXP3基因座（包含其TSDR区域，一个作为稳定Treg承诺抑制谱系最佳标志的调控元件）的更详细分析。研究的强效Treg的11个特征基因为：Foxp3、TNFRSF18（GITR）、CD25、IKZF2（Helios）、IKZF4（Eos）、CTLA4、TNFR2、CD62L、Fas、CD45和IL2。Ikaros家族转录因子（Helios和Eos）的纳入反映了它们在稳定Foxp3蛋白表达和确保Treg抑制功能中的关键作用。
主要发现是，BCG诱导了11个Treg特征基因中9个基因的绝大多数CpG位点在3年内逐渐进行性去甲基化。在基线时，Foxp3基因尤其相对于非糖尿病对照显著过度甲基化。三年后，其22个CpG位点中有17个发生去甲基化，包括TSDR区域。三年中，去甲基化的Treg基因在相似的时间点显示转录增加。未显示去甲基化的基因未显示mRNA变化。对TSDR位点进行了单独评估。到第58周，出现去甲基化增加的模式。在第58周时，通过流式细胞术测定的平均Treg群体相对于基线增加。该研究得出结论，多剂量BCG疗法通过Treg特征基因的表观遗传去甲基化触发长期强效Treg的诱导。时间过程与BCG血糖改善的时间相关。
T1D中Treg缺乏的另一个原因可能追溯到另一组被发现高度甲基化的基因。这一问题在BCG试验基线时被发现，当时参与者的T细胞被发现T细胞受体（TCR）密度存在定量缺陷，表明与非糖尿病对照相比表达降低。通过EPIC BeadChip分析，该缺陷被确定为T细胞受体（TCR）相关基因CpG位点高度甲基化的产物。200个最高度甲基化基因中有90个与TCR相关。研究排除了TCR序列重组。BCG治疗在三年内使相关基因去甲基化。功能后果——通过恢复TCR密度改善信号强度——通过蛋白质阵列评估，显示TCR信号通路中多个激酶磷酸化增加。改善的信号强度有可能恢复触发Treg增殖的信号，但这一点未被评估。
综合来看，这些研究表明，Treg特征基因的表观遗传重编程或TCR密度恢复可能有助于BCG诱导强效Treg。Treg的标准化有望恢复其控制自身免疫和炎症相关的细胞功能（和/或数量）。这可能有助于解释2期结果中T1D患者胰岛素剂量减少和HbA1c降低。LADA对BCG的反应是保留胰腺功能，这可能是自身免疫减弱的结果。这些功能的恢复也提示Treg活性增强：胰岛素抵抗减少和自身抗体减少。BCG免疫治疗在LADA中诱导Treg可能是该研究数据还显示多剂量BCG通过全身性消除炎症（已知原因）来消除胰岛素抵抗的原因。
8. 结论及对T1D治疗和预防的意义
六项临床试验的证据一致且可重复：对自身免疫性糖尿病进行少量剂量的BCG免疫治疗具有多种治疗优势：(1) 没有中度或重度全身不良事件；(2) 对长期T1D成人人群具有血糖疗效，这是临床上最常见但很少纳入试验的人群；(3) 减少胰岛素剂量；(4) 对LADA除血糖改善外还可防止胰岛素抵抗和减弱自身免疫；(5) 无需慢性给药即可产生持续数年的影响；(6) 价格实惠。
BCG作用机制的证据有助于解释因果链如何从DNA的表观遗传调节层面开始——一种能够在不改变序列的情况下实现长期稳定结局的机制；BCG如何重编程免疫细胞代谢和Treg激活；以及为什么BCG需要长达3年才能实现获益。免疫代谢的转变有助于解释BCG如何在无功能胰腺的成人中发挥作用——这些胰腺已被自身免疫破坏，不再能产生任何胰岛素。
由于BCG在美国不是获批疫苗且全球供应短缺，国际环境中的证据现在证实了BCG降低血糖、降低HbA1c水平以及降低自身抗体的能力。以出生时接种新生儿BCG疫苗或未接种BCG疫苗作为分层标准，只有接种过BCG疫苗的1型糖尿病成人表现出HbA1c降低、IDAA1c降低，以及Treg激活并伴随预期的糖酵解代谢物代谢增加。同样，成人期给予1型糖尿病受试者BCG改善了血糖控制，并在18个月测量中降低了自身抗体。HbA1c和自身抗体水平均下降，支持BCG在现有糖尿病中的治疗前景。还有一些回顾性证据支持BCG作为预防性干预，可延迟发病或降低T1D发病率。安全性、治疗获益、风险调节和潜在预防的证据表明，BCG通过独特的代谢和Treg机制，改善了糖尿病的护理和控制，这是标准治疗无法实现的。
