食源性沙门菌中可转移IncHI2相关blaLAP-2与blaCTX-M-55耐药平台

《Foods》：Transferable IncHI2-Associated blaLAP-2 and blaCTX-M-55 Resistance Platforms in Foodborne Salmonella

　　

食源性肠炎沙门菌（Salmonella enterica）中的超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase, ESBL）基因可通过移动性多重耐药（multidrug-resistance, MDR）平台传播。IncHI2质粒是重要耐药载体，能够携带复杂耐药区域并促进其在不同细菌背景间的水平转移，但共携带blaLAP-2与blaCTX-M-55的IncHI2元件的转移及基因组组织特征仍鲜有表征。研究人员调查了2022年上海分离的两株食源性多重耐药菌株：肠炎沙门菌Agona序列型13（ST13）Sal22C150与Havana序列型1527（ST1527）Sal22P208。研究开展了药物敏感性试验、全基因组测序、接合转移、质粒保留分析、比较基因组学及菌株与质粒水平系统发育分析。两株菌均表现广泛耐药，包括对超广谱头孢菌素的耐药。在两株菌中，blaLAP-2与blaCTX-M-55均随IncHI2复制子共转移至大肠杆菌（Escherichia coli）J53，转移频率分别为（4.95±0.41）×10?5和（4.46±0.42）×10?6转接合子/供体细胞。所有测试的质粒标记在无抗菌药物选择下传代20次仍可检出。Sal22P208完成组装确认三个β-内酰胺酶基因定位于275,096 bp的IncHI2质粒pSal22P208上；该质粒含保守接合骨架与镶嵌式附属区域，携带15个抗菌药物耐药决定簇及汞、碲耐药位点。基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）的分析将pSal22P208归入与6个参考IncHI2质粒高度相近的簇（差异<30 SNP），这些参考质粒源自动物、食品及人源的沙门菌与大肠杆菌，提示该质粒谱系在多样细菌与生态背景中广泛分布。Sal22P208还在rpmJ与rpmE之间含Tn3相关染色体MDR区域，与布拉克柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）LBA3同源区域结构高度相似。上述发现凸显了可转移IncHI2耐药平台在连锁耐药决定簇水平传播及转移后短期维持中的作用，而染色体整合耐药区域可为食源性沙门菌MDR积累与遗传提供额外途径。

研究背景与立项依据

非伤寒沙门菌（Salmonella enterica）是重要食源性病原体，其对抗菌药物的耐药尤其是超广谱头孢菌素与氟喹诺酮类耐药已成公共卫生焦点。CTX-M-55在亚洲食品动物与食源菌中流行上升，而LAP-2类A β-内酰胺酶虽已在肠杆菌目多属检出，但与bla_CTX-M-55共载于可转移多重耐药平台的证据有限。IncHI2质粒具广宿主、模块化架构，常同时携抗菌与金属耐药基因，但共载上述两β-内酰胺酶基因的IncHI2平台在食源性Agona与Havana等少见血清型中的转移性、稳定性及模块组织仍不清楚。本研究以上海2022年零售鸡肉（Sal22C150，S. Agona ST13）与猪肉（Sal22P208，S. Havana ST1527）分离株为对象，发表于《Foods》，旨在从功能与基因组双视角阐明IncHI2质粒与染色体整合区对食源沙门菌MDR传播的贡献。

主要技术方法概括

研究人员采用两株食源性沙门菌临床监测分离株，结合琼脂稀释与肉汤微量稀释法作药物敏感性测定（CLSI M100 34版判读）；Sal22C150行Illumina短读长测序，Sal22P208行Illumina+PacBio混合组装获完整基因组；以大肠杆菌J53为受体行肉汤接合、计算转移频率并做20代无选择传代保留试验；用ResFinder、PlasmidFinder、ISfinder、oriTfinder2定耐药基因/复制子/移动元件；以kSNP构建IncHI2质粒及菌株染色体SNP系统发育树，BRIG、Easyfig作质粒与染色体区域共线性比较。

研究结果

3.1 分离株身份、表型与基因组耐药谱

两株分属S. Agona ST13与S. Havana ST1527，表型均耐磺胺异噁唑、萘啶酸、氧氟沙星、环丙沙星、氨苄西林、头孢噻肟、头孢吡肟、氯霉素、链霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、利福平、阿奇霉素、磷霉素、四环素，对替加环素中介，对美罗培南、黏菌素敏感，符合MDR定义。共享耐药组含aac(3)-IId、aac(6′)-Iaa、aadA22、aph(3′)-Ia、aph(6)-Id、bla_CTX-M-55、bla_LAP-2、bla_TEM-1B、dfrA14、floR、fosA7、lnu(F)、mph(A)、qnrS1、sul3、arr-2、tet(A)；Sal22C150独有aph(3″)-Ib，Sal22P208独有arr-3、aac(6′)-Ib-cr、aadA16、dfrA27、qnrB6、sul1。完整组装证实Sal22P208中三β-内酰胺酶基因位于IncHI2质粒，Sal22C150中两基因与IncHI2复制子共定位由短读长上下文与接合证据推断。

3.2 IncHI2相关耐药决定簇的接合转移与短期维持

以J53为受体两株均获转接合子，IncHI2复制子、bla_LAP-2、bla_CTX-M-55同步检出，转移频率分别为（4.95±0.41）×10^?5与（4.46±0.42）×10^?6（前者显著更高）。转接合子对磺胺、喹诺酮、氨苄西林、头孢菌素、氯霉素、氨基糖苷、大环内酯、四环素MIC较受体升高，但阿米卡星、磷霉素、美罗培南、黏菌素MIC不变。无药传代20次，上述三标记均未丢失，证明转移后短期可不依赖选择压维持。

3.3 pSal22P208完整结构与镶嵌附属区

Sal22P208染色体4,853,117 bp，质粒pSal22P208 275,096 bp，含保守转移骨架（oriT、relaxase、IV型偶联蛋白、traG/H/F/I/D）。耐药基因集中于附属区：三β-内酰胺酶基因为核心，伴aph(6)-Id、aadA/ant(3″)-Ia家族、aac(3)-IId、aph(3′)-Ia、floR、tet(A)、sul3、lnu(F)、qnrS1、mph(A)、arr-2、dfrA14；金属耐药含汞位点merR/P/T/C/A/D/E与碲位点terW/Z/A/B/C/D/E。bla_LAP-2–ftsI–bla_TEM-1B与bla_CTX-M-55嵌于IS26、IS4/IS2/IS3家族及Tn3/Tn21富集区，呈多模块分割而非单一盒式结构。汞耐药区与Phytobacter ursingii质粒pCAV1151-296同源但侧翼IS不同（本质粒侧IS6家族，参比侧IS903B）。

3.4 研究株与pSal22P208系统发育定位

pSal22P208与54个共载两β-内酰胺酶基因IncHI2参比质粒建树，归入紧密簇，与6个参比（鸡源S. Muenster MN539017.1、鸡源S. Schwarzengrund CP084217.1、牛源E. coli CP074357.1、人源E. coli CP071712.1、小牛肉E. coli CP063719.1、鸡源S. Kentucky CP039440.1）差异<30 SNP，跨中、加、美、越及沙门菌/大肠杆菌宿主。染色体SNP树中Sal22P208（S. Havana）与英国临床株GCA_007343335.1差<30 SNP；Sal22C150（S. Agona）与澳洲GCA_012169275.1差<50 SNP且与台湾株成紧凑群。

3.5 Sal22P208染色体MDR区域

染色体rpmJ–rpmE间插入大片段MDR区（S. Agona SL483无此插入），边界关联Tn3家族。含tet(A)、floR、aac(6′)-Ib-cr、arr-3、dfrA27、aadA16、qnrB6、qacEΔ1、sul1及砷耐药簇，移动元件含ISVsa3、IS26、ISCR1、IS6100，两段qacEΔ1–sul1与1类整合子相关。该结构与C. braakii LBA3（CP113163）染色体同源区在边界、砷位点、tet(A)–floR模块及整合子–ISCR1段基因顺序上高度保守。

讨论部分总结

研究人员指出，本研究价值不在单个β-内酰胺酶基因而在其遗传语境：IncHI2平台将bla_LAP-2与bla_CTX-M-55与多类耐药基因物理连锁，接合转移+无选维持使连锁共选成为可能。转移频率与已知IncHI2相当，喹诺酮MIC部分升高因qnrB6/aac(6′)-Ib-cr在Sal22P208染色体而非质粒。pSal22P208骨架保守、附属区经IS26/Tn3/Tn21反复重塑，汞/碲耐药与抗菌耐药同载提示环境金属也可共选。质粒系统发育跨物种跨源分布说明仅以MLST/染色体树监测会低估移动元件水平播散，须将质粒与染色体插入结构并入监测。Sal22P208同时具可转移质粒与染色体MDR插入，示明“质粒水平传播+染色体稳定遗传”双路径；与C. braakii LBA3同源提示同构移动模块可跨属定植，但方向不能由相似推断。两株样本量小，不代表人群流行率。

结论部分翻译

本研究表征了食源性S. Agona与S. Havana中可转移IncHI2相关共载bla_LAP-2与bla_CTX-M-55的耐药元件。完整组装确认这些决定簇定位于pSal22P208，Sal22C150中其与可转移IncHI2元件的关联由短读长基因组与接合证据支持。所证转移与转移后短期维持，连同pSal22P208的镶嵌附属结构及Sal22P208染色体MDR区，阐释了沙门菌中耐药积累与传播的互补途径。这些发现支持同时解析质粒与染色体耐药语境的基因组监测。