食品和婴儿配方食品中cereulide的LC-MS/MS测定：方法验证及意大利六年调查

《Foods》：LC-MS/MS Determination of Cereulide in Food and Infant Formula: Method Validation and Six-Year Survey in Italy

　　

在能够产生毒素的致病微生物中，蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）在食源性疾病中扮演着重要角色。该菌负责产生cereulide，一种对热和酸性pH非常稳定的环状十二肽毒素，可导致呕吐综合征。该研究描述了在浓度为1–100 μg/kg范围内针对食品基质的ISO 18465方法的二次验证，以及针对婴儿配方食品的、灵敏度更高的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的内部验证，该方法的检测浓度可达到欧洲食品安全局（EFSA）自2026年起要求的较低浓度水平。为提高cereulide在婴儿配方食品中测定的适用性，研究人员在提取前将固体基质复溶，并使用SCIEX QTRAP 7500系统进行分析。该方法显示出良好的线性（0.010–1.000 μg/L，R² = 1000），定量限等于最大限量水平的一半（LM = 0.054 μg/L，LOQ = 0.025 μg/L），良好的回收率（100–109%）以及可接受的实验室内重现性（RSD% < 15%）。该方法为ISO 18465先前未涵盖的多种食品中cereulide的监测提供了可靠的分析工具，并使其能够达到为婴儿配方食品设定的新的更低限量。此外，这项回顾性研究还提供了2019年至2024年期间意大利332份疑似食物中毒样本的数据。

**论文解读：食品与婴儿配方食品中cereulide的LC-MS/MS测定方法验证及六年监测研究**

**研究背景与目的**
细菌毒素是欧洲食源性疾病的主要诱因之一。欧盟近年报告显示，细菌毒素已成为食源性爆发事件（FBO）中第二大常见病因，其中蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）产生的呕吐毒素cereulide因其高度的热稳定性和耐酸性，对食品安全构成持续威胁。现有的国际标准方法ISO 18465:2017虽能有效测定富含淀粉基质（如大米、意大利面、土豆）中的cereulide，但其适用范围有限，且定量限（LOQ）为1 μg/kg，无法满足欧洲食品安全局（EFSA）针对婴儿配方食品设定的更严格限量要求（如新生儿配方中0.054 μg/L的水平）。此外，婴儿配方食品基质复杂，脂质-蛋白复合物及包埋成分会导致毒素释放不完全。因此，本研究旨在评估EN-ISO 18465:2017在更广泛食品基质中的适用性，并对能够达到EFSA风险评估确立的低限量水平的婴儿配方食品定量方法进行内部验证。该研究发表在《Foods》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用稳定同位素稀释分析（SIDA）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，以¹³C₆-cereulide为内标。样本涉及2019–2024年期间由意大利当地卫生部门送检至皮埃蒙特、利古里亚和瓦莱达奥斯塔实验动物预防研究所（IZSPLV）的332份疑似食物中毒相关食品。针对婴儿配方食品，方法采用40℃水浴复溶固体基质后再进行提取。

**研究结果与讨论**
- **样品前处理改进**：对于食品基质，研究人员发现大米在提取溶剂中易形成致密团聚体，因此引入Ultra-Turrax额外均质化步骤以提高提取效率；所有样品均强制采用正庚烷脱脂以去除干扰物。对于婴儿配方食品，研究证实直接对干粉进行有机溶剂提取会导致回收率偏低，因此采用按说明书比例40℃复溶的方式模拟即食状态，之后用乙腈提取，该流程简单快速，无需固相萃取（SPE）纯化步骤即可达到所需灵敏度。
- **LC-MS/MS分析与仪器适用性**：研究优化了电喷雾离子源和串联质谱参数，选择m/z 1170.6的铵加合物[M+NH₄]⁺为前体离子，并监测五个子离子，获得9.5个识别点，符合法规确认标准。色谱柱筛选表明，X-Select HSS T3 C18柱配合甲醇流动相可获得最佳峰形和信噪比，且分析时间缩短至15分钟。在灵敏度对比中，SCIEX QTRAP 7500系统比QTRAP 6500+响应高约五倍，是唯一能够达到婴儿配方食品≤0.025 μg/L定量限要求的仪器。
- **ISO 18465方法适用性评估**：通过5μg/kg和25μg/kg加标水平的重复性与回收率实验，研究确认实验室内重复性标准差（s_r = 0.46）满足ISO 18465规定的重现性接受标准（σ_r = 0.80），回收率在90%–116%之间。利用有证标准物质（CRM）验证正确度，测得值为11.1 μg/kg，与认定值11.3 ± 0.8 μg/kg吻合。在含肉、蔬菜等不同配菜的复杂膳食中未检测到干扰，平均回收率为100%，表明该方法适用于多种实际膳食样本。
- **婴儿配方食品方法内部验证**：方法在0.010–1.000 μg/L范围内线性良好（R² = 1.000）。基质效应在婴儿配方中为96%，在较大婴儿配方中为89%，表明离子抑制较低；提取回收率分别为88%和92%。正确度范围在102%–109%之间，符合法规要求；实验室内重现性CV% ≤ 13%。方法耐用性通过Youden法验证，稳定性测试显示终提取液在-20℃可稳定一周，标准溶液可稳定近三年。方法定量限（mLOQ）设为0.025 μg/L，为EFSA关注水平（0.054 μg/L）的一半。扩展相对测量不确定度为23%，低于参考法规中50%的指示性最大不确定度。
- **质量控制保证**：在六年常规分析中，每批均设置空白基质和加标质控样，未出现假阳性或假阴性结果。质控图表明方法性能稳定，CRM分析进一步确认了正确度。
- **六年调查结果**：332份疑似食物中毒样本中，5份检出cereulide阳性。包括自制土豆鲜虾鱿鱼沙拉（1.05 μg/kg）、意大利薄饼（532 μg/kg）、两份poké bowl（13 μg/kg和25 μg/kg）以及一份意式炸饭团（2000 μg/kg）。估算食用一份炸饭团（约150–200 g）可使60 kg成人摄入约8.7 μg/kg体重的cereulide，与文献报道的致吐剂量（8–10 μg/kg）高度一致。阳性样本中有60%以大米为原料，20%含土豆，说明高淀粉含量食物是cereulide污染的主要风险来源。

**讨论总结与结论**
本研究将ISO 18465的扩展验证、婴儿配方食品专属方法建立和疫情样本监测有机结合，构建了跨基质的cereulide综合分析框架。SIDA内标有效校正了提取损失并简化了工作流程。研究证明，改进的ISO 18465方法对于常规食品是稳健、灵敏的，而QTRAP 7500是实现婴儿配方食品高灵敏检测的关键工具；免去SPE步骤的简便前处理提高了分析效率。六年调查数据证实了该方法在食物中毒事件调查中的实用性，阳性样本中检测到的毒素水平与文献一致，但阳性样本数量有限，无法进行统计学关联推断。该研究为应对日益严格的监管要求和强化食品安全监测网络提供了可靠的技术支撑。