微生物来源的大豆苷（Eco-3）通过靶向TBK1–NFATc1信号轴抑制RANKL诱导的破骨细胞生成

《International Journal of Molecular Sciences》：Microbial-Derived Daidzin (Eco-3) Suppresses RANKL-Induced Osteoclastogenesis by Targeting the TBK1–NFATc1 Signaling Axis

　　

Eco-3是一种微生物来源的大豆苷，据报道具有多种生物活性；然而，其对于破骨细胞分化（osteoclast differentiation）的影响及潜在分子机制尚不清楚。在本研究中，研究人员利用RAW264.7巨噬细胞（RAW264.7 macrophages）研究了Eco-3对核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）诱导的破骨细胞生成（osteoclastogenesis）的影响，并探讨了所涉及的信号通路。Eco-3在测试浓度下抑制了RANKL诱导的破骨细胞形成，且未显著影响细胞活力。Eco-3还改变了F-肌动蛋白（F-actin）组织，并降低了关键破骨细胞生成标志物的表达，包括抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）、活化T细胞核因子c1（nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1）、c-Fos和组织蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）。特别是，Eco-3在破骨细胞分化早期减弱了NFATc1的表达，提示其干扰了与破骨细胞生成相关的转录程序。此外，RANKL刺激在破骨细胞分化期间逐渐增加TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）的磷酸化，而Eco-3减弱了这种激活。TBK1的基因沉默（gene silencing）抑制了破骨细胞形成，而TBK1的药理学抑制降低了TBK1磷酸化、破骨细胞生成基因表达和破骨细胞形成。总之，这些发现表明Eco-3至少部分通过调节RAW264.7巨噬细胞中的TBK1–NFATc1信号轴来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。研究人员的研究结果将TBK1确定为破骨细胞分化的潜在调控组分，并提示Eco-3作为破骨细胞相关骨疾病的潜在生物活性候选物值得进一步研究。

论文解读：微生物来源大豆苷Eco-3通过TBK1–NFATc1信号轴抑制RANKL诱导的破骨细胞生成

骨重塑（bone remodeling）是维持骨骼完整性的动态生理过程，依赖骨形成成骨细胞（osteoblast）与骨吸收破骨细胞（osteoclast）之间的紧密平衡。当破骨细胞过度活化时，可导致骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎及药物相关性颌骨坏死等骨破坏性疾病。RANKL诱导的破骨细胞分化受多条胞内信号通路调控，并最终汇聚于活化T细胞核因子c1（nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1），后者是调控破骨细胞生成的关键转录因子。TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，已知参与先天免疫、炎症信号、自噬和I型干扰素应答，但其在骨骼稳态及破骨细胞信号中的具体作用仍不明确。天然产物及其衍生物因具有多样生物活性而受到关注，微生物生物转化可产生结构修饰的类黄酮和异黄酮衍生物。Eco-3是通过嗜线虫致病杆菌（Xenorhabdus nematophila）生物转化获得的一种微生物来源大豆苷（daidzin），既往研究发现其具有抑制脂肪生成活性，但对破骨细胞分化的作用及分子机制尚属未知。为此，研究人员在RAW264.7巨噬细胞中评估了Eco-3对RANKL诱导破骨细胞生成的影响，并重点探讨TBK1–NFATc1信号轴是否参与其中。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

研究人员以RAW264.7小鼠巨噬细胞（来源于美国典型培养物保藏中心，ATCC）为细胞模型，采用重组RANKL诱导破骨细胞分化；通过TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色评估破骨细胞形成，F-actin荧光染色观察细胞骨架组织；运用Western blot检测NFATc1、磷酸化TBK1（p-TBK1）和总TBK1（T-TBK1）蛋白表达；采用半定量RT-PCR检测TRAP、NFATc1、c-Fos和CTSK mRNA表达；利用TBK1特异性短发夹RNA（short-hairpin RNA，shRNA）进行基因沉默；使用TBK1抑制剂GSK8612进行药理学抑制；并通过台盼蓝排斥法和MTS法评估细胞活力。

研究结果如下。2.1 建立RANKL诱导的RAW264.7巨噬细胞破骨细胞分化模型：用30或50 ng/mL RANKL处理7天后，TRAP染色和荧光成像显示出现多核TRAP阳性破骨样细胞，故选取50 ng/mL作为后续工作浓度。2.2 Eco-3抑制RANKL诱导的破骨细胞分化且无明显细胞毒性：Eco-3（5、10、20 μg/mL）降低TRAP阳性破骨细胞面积，且不影响细胞存活和活力。2.3 Eco-3改变RANKL诱导破骨细胞分化过程中的F-actin组织：Eco-3处理后F-actin荧光强度降低，但该结果来自单次独立实验，需谨慎解读。2.4 Eco-3抑制NFATc1表达和破骨细胞生成基因表达：Western blot显示Eco-3在第3天减弱RANKL诱导的NFATc1蛋白表达；RT-PCR显示Eco-3降低TRAP、NFATc1、c-Fos和CTSK mRNA表达，其中CTSK降低尤为显著。2.5 Eco-3减弱RANKL诱导破骨细胞分化过程中的TBK1活化：RANKL刺激使TBK1磷酸化逐渐增加，尤其在分化晚期明显，Eco-3可减弱该磷酸化激活，而总TBK1表达不变。2.6 TBK1敲低抑制RANKL诱导的破骨细胞分化且不影响细胞存活：TBK1特异性shRNA敲低后，RANKL诱导的TRAP阳性破骨细胞形成减少，细胞存活无明显变化。2.7 TBK1药理学抑制抑制破骨细胞生成基因表达和破骨细胞分化：TBK1抑制剂GSK8612降低RANKL诱导的TBK1磷酸化，下调NFATc1、TRAP和c-Fos mRNA表达，并减少TRAP阳性破骨细胞形成。

讨论部分指出，Eco-3抑制破骨细胞分化与NFATc1及下游破骨细胞生成基因下调一致，并影响F-actin组织，提示其可能也干预破骨细胞成熟相关过程。TBK1在破骨细胞生成中磷酸化增加，Eco-3抑制该活化；基因沉默和药理学抑制TBK1均抑制破骨细胞形成，支持TBK1在破骨细胞生成中的功能性作用。既往研究曾报道TBK1可通过TRAF6–TAK1或STING依赖信号负调控破骨细胞生成，而本研究结果提示TBK1在RAW264.7巨噬细胞中可能正向促进RANKL诱导的破骨细胞分化，这种差异可能源于细胞模型、分化阶段或实验条件的不同。研究结论为：Eco-3抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，并减弱TBK1活化和NFATc1相关的破骨细胞生成信号。TBK1–NFATc1信号关系可能是调控破骨细胞生成的一个此前未充分认识的机制，并可能成为破骨细胞过度活化相关疾病的潜在治疗靶点。Eco-3作为微生物来源大豆苷，具有抗破骨细胞生成潜力，值得进一步研究。