多肽多孔板光介导脱硫及其组合库合成

《Molecules》：Light-Mediated Desulfurization of Peptides in Multi-Well Format for Combinatorial Library Synthesis

　　

原生化学连接(NCL)结合连接后脱硫是连接未保护肽段以形成大多肽或头尾环化肽的有力策略。然而，适用于高通量合成流程的简单、稳健且安全的脱硫方案尚未开发。研究人员提出一种光化学策略，在270 nm紫外(UV)照射及三(2-羧乙基)膦(TCEP)存在下实现脱硫。反应条件优化后效率与现有化学脱硫相当。组合肽库脱硫证实该策略兼容所有标准氨基酸及硫醇保护半胱氨酸。在96孔板中用定制发光二极管(LED)阵列实施优化条件，确认产物生成依赖局部光照；增大板与光源距离可均匀化照射，获得均一产物。综上，该研究确立UV介导脱硫作为高通量肽合成流程中安全可放大的替代方案。

研究背景与立项依据

肽类药物因靶标特异性高、免疫原性低于生物制剂而备受关注，头尾环化肽代谢稳定性更优。原生化学连接(NCL)利用N端半胱氨酸与C端硫酯在接近中性水相中连接，连接后脱硫将连接点半胱氨酸转为丙氨酸，从而复原天然序列或借助β/γ-硫代非天然氨基酸实现“无痕”环肽。现有化学脱硫依赖VA-044等自由基引发剂或NaBEt₄等硼试剂配合TCEP：NaBEt₄虽秒级完成但自燃且需酸性条件，超声、电化学及可见光/紫外光催化方案各有局限。亟需一种无光催化剂、无自由基引发剂、水性安全、可多孔板并行的高通量脱硫工艺。论文发表于《Molecules》。

主要关键技术方法

研究人员以线性模型肽LNDSACALVEE-NH₂及头尾环化类似物为基底，在100 mM磷酸盐缓冲液(PB, pH 7)中以265–270 nm单颗UV LED或定制270 nm LED阵列（第一代4×3、第二代4×3加3×2共18颗）照射，TCEP 10当量，开放体系30–180分钟；用LCMS于220 nm按峰面积定量转化，UPLC-CAD标定浓度，NMR确证Cys→Ala；96孔聚丙烯深孔板距阵35–80 mm梯度验证照度均匀性，Zemax模拟照度热图与产物热图比对；组合库11条含芳香/碱性/双Cys/硫醚/Thz/三唑肽同步验证底物广度。

研究结果

2.1 反应条件优化：比较265 nm与275 nm LED，265 nm（实测267.9 nm）30分钟转化更优；TCEP 10与20当量近全转化，选定10当量；MeCN升高降低效率，氮鼓泡脱气在含MeCN体系中提升显著（50% MeCN由23%升至54%）；pH 6下降、pH 7–8相当、Tris缓冲pH 9略升，最终选PB pH 7兼顾NCL兼容性；NMR确证Cys CH₂（δ_H 2.76/2.68 ppm）消失、Ala CH₃（δ_H 1.24 ppm）出现。

2.2 反应效率定量：线性与环化模型肽30分钟脱硫率均约71%，起始物料剩4%–7%，总峰面积不变说明约25%走副反应；与Sun等NaBEt₄（20当量）+TCEP（5当量）比，光法64%–71%略优于硼法64%，但光法需30分钟而硼法秒级。

2.3 序列适用范围：11肽组合库含Trp/Tyr/Lys/Arg、双Cys、Met、Cys(Acm)、Thz（脱硫后成Val）、青霉胺、1,2,3-三唑；多数>85%转化，肽3（10分钟避氧化）最快，肽9<50%，肽11伴Thz脱保及双脱硫副产物（?44 Da）；Met与Acm-Cys硫醚不被还原，双Cys可同步脱硫，证明对多样官能团耐受。

2.4 多孔板光脱硫：第一代270 nm阵35 mm距45分钟平均产率35.7±13.0%，热图与模拟照度空间强相关；42.5 mm降至29.1±7.5%但更匀；80 mm需180分钟达75.9±3.9%；聚丙烯板<300 nm近零透射致斜光遮挡，建议石英/环烯烃板。第二代18颗阵50 mm、130分钟、平均照度15.01 mW/cm²得94.0±1.0%均一转化，板温<26 ℃。组合库在96孔复现高转化，同肽孔间一致。

2.5 展望：均一照度为多孔均一产物前提；MeCN体系可借脱气缓速；该工艺一锅连接脱硫、无外源氢供体/引发剂/光催化剂、免自燃试剂与酸化，属“无人值守”安全流程；UV LED阵有望拓展至板格式其他肽光化学修饰。

讨论与结论翻译

讨论指出均匀辐照是确保各孔均一产物的关键，MeCN缓冲液速率降低可用脱气缓解；相比LiBEt₃H、NaBH₄或NaBEt₄，本法则剔除自燃试剂与前酸化步骤，简化操作并提升高通量安全性；LED阵或可承载更广肽光转化。

结论：研究人员开发了一种操作简易的脱硫策略，用LED阵在板格式并行脱硫多底物；~270 nm UV与10当量TCEP即达最快转化，无需光催化剂或自由基引发剂，仅用水溶性膦试剂；方法兼容多类官能团；板内产物与局部照度直接相关，均一辐照决定均一性——这是首例板格式光介导组合肽库脱硫。UV LED阵在肽高通量合成中具超出脱硫的潜力。