《Cancers》：TPPP3 Overexpression Suppresses Nasopharyngeal Carcinoma Progression and Promotes Immune Microenvironment Remodeling Through HSPA8 Association
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摘要
目的：鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）起源于免疫抑制微环境，这种微环境常削弱治疗效果。TPPP3已被认为与NPC侵袭性的负性调控有关，但其与免疫调节或分子伴侣网络的关联仍不明确。因此，研究团队旨在确定TPPP3如何塑造N
摘要
目的：鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）起源于免疫抑制微环境，这种微环境常削弱治疗效果。TPPP3已被认为与NPC侵袭性的负性调控有关，但其与免疫调节或分子伴侣网络的关联仍不明确。因此，研究团队旨在确定TPPP3如何塑造NPC的免疫图谱，并鉴定其相互作用的蛋白伙伴。
方法：使用R软件分析来自头颈部鳞状细胞癌和鼻咽癌的公共单细胞RNA测序数据集。建立了稳定过表达TPPP3的HK-1和C666-1细胞系。利用这些细胞构建人源化异种移植瘤模型，并通过免疫组织化学评估瘤内免疫细胞浸润情况。在体外，将这些细胞及其对照与外周血单核细胞进行间接共培养。对TPPP3过表达细胞的裂解物进行免疫沉淀-质谱联用和免疫荧光染色，鉴定出HSPA8为TPPP3相互作用蛋白。随后，在伤口愈合、集落形成、细胞周期和异种移植实验中比较了对照组、TPPP3过表达组以及TPPP3过表达联合HSPA8抑制剂VER155008组三组，并对肿瘤切片进行Ki67、TPPP3和CD3的免疫组织化学染色。
结果：TPPP3转录本在大多数肿瘤细胞亚群中几乎检测不到，但在NPC上皮细胞簇中显示出相对富集。强制表达TPPP3抑制了异种移植瘤的生长，同时增加了瘤内CD3+ T细胞、CD8+ T细胞和CD11c+树突状细胞的丰度。使用VER155008对HSPA8进行药理学阻断进一步增强了TPPP3驱动的迁移抑制、克隆形成抑制和肿瘤扩张抑制作用，还改变了细胞周期进程，同时促进了移植物内CD3+ T细胞的积聚。
结论：这些发现提示TPPP3与HSPA8之间存在功能性关联，这种关联可能有助于NPC中的肿瘤生长抑制和免疫微环境重塑。对HSPA8依赖性蛋白质稳态的药理学破坏在体外和体内模型中均增强了TPPP3相关的抗肿瘤活性，表明该分子伴侣通路代表了一种值得进一步机制研究和治疗探索的候选机制。
**论文解读：TPPP3-HSPA8功能性关联在鼻咽癌进展抑制与免疫微环境重塑中的作用机制研究**
**1. 研究背景与科学问题**
鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种与EB病毒（Epstein–Barr virus，EBV）感染密切相关的上皮性恶性肿瘤，具有显著的地理聚集性和人群分布特异性。EBV编码的产物通过激活多种信号通路（如NF-κB和PI3K/Akt）促进上皮细胞恶性转化，同时诱导免疫抑制性微环境的形成。单细胞转录组分析已证明，NPC组织中CD8+细胞毒性T细胞的耗竭水平和CD11c+树突状细胞的浸润密度与患者预后及免疫治疗应答显著相关。树突状细胞功能障碍直接导致免疫“冷”肿瘤表型，是限制治疗疗效的关键机制。
微管聚合促进蛋白家族成员3（tubulin polymerization-promoting protein family member 3，TPPP3）在调节微管动力学和维持细胞骨架稳态中发挥关键作用。在头颈部鳞状细胞癌中，TPPP3低表达与不良预后和抗肿瘤免疫细胞浸润减少密切相关。然而，其在NPC中的免疫调节作用及分子机制尚未明确。热休克相关蛋白71-kDa（heat shock-associated protein 71-kDa，HSPA8，又称HSC70）是一种组成型表达的分子伴侣，参与蛋白质折叠、伴侣介导的自噬和抗原呈递。HSPA8在多种肿瘤中异常调节并可促进肿瘤进展，同时能够直接结合并稳定MHC-II分子以调节抗原呈递和适应性免疫。
尽管TPPP3在NPC中的肿瘤抑制作用已有初步报道，但TPPP3与HSPA8之间的直接相互作用及其在NPC中的功能意义尚未被研究。因此，本研究旨在阐明TPPP3在NPC中的肿瘤抑制效应，验证TPPP3-HSPA8关联的功能重要性，并为改善免疫治疗患者的目标干预选择和设计提供理论依据。
**2. 研究内容与结论**
研究人员首先利用公共单细胞RNA测序数据集分析了TPPP3在头颈部鳞状细胞癌和NPC微环境中的表达模式，发现TPPP3转录本在大多数肿瘤细胞亚群中几乎检测不到，但在NPC上皮细胞簇中相对富集。基于此，研究人员构建了稳定过表达TPPP3的HK-1和C666-1细胞系，并利用这些细胞建立了人源化异种移植瘤模型。
研究结果表明，TPPP3过表达显著抑制了异种移植瘤的生长，同时增加了瘤内CD3+ T细胞、CD8+ T细胞和CD11c+树突状细胞的浸润。通过免疫沉淀-质谱联用技术，研究人员鉴定出HSPA8为TPPP3相互作用蛋白，免疫荧光实验证实两者共定位于细胞质。使用HSPA8抑制剂VER155008进行药理学阻断后，TPPP3过表达介导的迁移抑制、克隆形成抑制和肿瘤生长抑制作用进一步增强，并伴随细胞周期G0/G1期阻滞的加重和瘤内CD3+ T细胞浸润的进一步增加。
该研究确立了TPPP3作为NPC肿瘤抑制因子的地位，并将其生物学作用扩展至局部免疫微环境重塑。TPPP3与HSPA8的功能性关联整合了肿瘤细胞蛋白质稳态与免疫调节，提示HSPA8依赖性分子伴侣活性是值得进一步评估的候选治疗靶点。
**3. 关键技术与方法**
研究人员运用多种关键技术开展研究：①生物信息学分析，使用R软件（版本4.5.0）的GEOquery和Seurat包处理来自GEO数据库的公共转录组数据，包括HNSCC单细胞数据集GSE103322和NPC数据集GSE120926；②慢病毒介导的基因过表达技术，建立TPPP3稳定过表达的HK-1和C666-1细胞系（细胞系由广西医科大学耳鼻咽喉科实验室提供）；③人源化异种移植瘤模型，使用雌性huHSC-NCG小鼠（购自南京GemPharmatech）进行皮下移植实验；④免疫沉淀-质谱联用技术，使用Q-Exactive HF-X质谱仪鉴定TPPP3相互作用蛋白；⑤流式细胞术，分析共培养后PBMC中CD3+CD8+ T细胞比例及细胞周期分布。
**4. 研究结果**
**4.1 基于GEO单细胞数据的HNSCC和NPC中TPPP3表达模式**
通过分析GSE103322数据集的t-SNE和UMAP可视化结果，研究人员发现TPPP3在HNSCC所有细胞群体中表达均较低，恶性细胞中可见散在信号，非恶性细胞中几乎无信号。对GSE120926数据集的分析同样显示TPPP3在大多数NPC细胞群体中信号微弱，但差异表达分析显示TPPP3在上皮细胞中相对富集（avg log2FC = 2.75，p < 0.0001）。这些结果表明TPPP3绝对表达量低，但在NPC中表现出相对上皮细胞偏好性。
**4.2 慢病毒介导的TPPP3过表达细胞模型的构建与验证**
研究人员使用携带TPPP3或空载体的GFP表达慢病毒载体转导HK-1和C666-1细胞，经嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。RT-qPCR证实两种细胞模型中OE细胞的TPPP3 mRNA丰度显著高于NC细胞，Western blotting在蛋白质水平确认了TPPP3过表达的成功。
**4.3 TPPP3过表达抑制异种移植瘤生长并重塑免疫细胞浸润**
**4.3.1 体内肿瘤生长抑制与免疫浸润增强**
在huHSC-NCG小鼠模型中，TPPP3过表达组肿瘤体积显著小于对照组。HK-1模型中，NC组平均肿瘤体积为1388 ± 335.6 mm3，OE组为751.7 ± 220.9 mm3；C666-1模型中，NC组为772.9 ± 170.6 mm3，OE组为512.1 ± 91.67 mm3。免疫组织化学分析显示，TPPP3 OE肿瘤中CD3+ T细胞、CD8+ T细胞和CD11c+树突状细胞的密度均高于NC肿瘤。
**4.3.2 Transwell共培养体系评估T细胞活化情况**
利用Transwell间接共培养体系将人PBMC与TPPP3-OE或对照NPC细胞共培养后，流式细胞术分析显示部分供体来源的PBMC在与OE细胞共培养后CD3+CD8+ T细胞比例呈上升趋势，但合并分析未达到统计学显著性，表明该简化体外条件下的应答具有异质性。
**4.4 HSPA8被鉴定为TPPP3相关蛋白的候选分子**
对稳定过表达FLAG-TPPP3的HK-1和C666-1细胞进行FLAG-based免疫沉淀分析，质谱鉴定结果显示HSPA8在两种细胞系中均持续富集，鉴定分数分别为123.64和133.71。免疫荧光分析进一步显示两种蛋白均定位于细胞质。
**4.5 HSPA8抑制增强NPC细胞中TPPP3相关的抗肿瘤表型**
应用HSPA8/HSP70抑制剂VER155008处理后，HSPA8蛋白稳定性受损、丰度降低，同时伴随TPPP3表达轻度下降。伤口愈合实验显示OE细胞伤口闭合率显著低于NC细胞，VER155008处理进一步增强该效应。集落形成实验显示OE细胞集落数量和大小均显著减少，VER155008处理后进一步降低。流式细胞术显示，在HK-1细胞中，TPPP3过表达联合VER155008导致显著的G0/G1期阻滞和G2/M期比例降低；在C666-1细胞中，TPPP3过表达导致G0/G1期轻度增加和S期细胞减少，VER155008进一步增强了G0/G1期积聚并抑制S期进入。
**4.6 HSPA8抑制联合TPPP3过表达抑制异种移植瘤生长并增强瘤内CD3+ T细胞浸润**
体内验证实验中，两个模型均显示OE肿瘤显著小于NC肿瘤，VER155008处理后进一步减小。免疫组织化学分析显示，NC肿瘤中TPPP3染色弱且局灶性，OE肿瘤染色强且弥漫，OE+VER155008组TPPP3信号较OE组轻度降低但仍高于NC组。Ki-67染色在OE和OE+VER155008组均显著降低。CD3+ T细胞浸润在NC肿瘤中稀疏，OE肿瘤中增加，VER155008处理后进一步增强。
**5. 结论**
该研究确立了TPPP3作为NPC肿瘤抑制因子的地位，并将其生物学作用扩展至局部免疫微环境重塑。TPPP3过表达限制了异种移植瘤的生长并增加了瘤内T细胞和树突状细胞浸润，同时HSPA8在两个NPC模型中被重复鉴定为TPPP3相关蛋白。对HSPA8/HSP70分子伴侣网络的药理学破坏进一步增强了抗迁移、抗克隆形成、细胞周期和体内肿瘤抑制效应，并促进了CD3+ T细胞浸润。这些趋同的发现表明，TPPP3与HSPA8之间存在功能性关联，该关联整合了肿瘤细胞蛋白质稳态与免疫调节，并提名HSPA8依赖性分子伴侣活性作为NPC中值得进一步评估的候选治疗脆弱性。
