miR-424-5p通过靶向FZD4调控骨肉瘤干细胞样和恶性表型

《Cancers》：miR-424-5p Regulates Stem-like and Malignant Phenotypes in Osteosarcoma by Targeting FZD4

　　

简单总结：骨肉瘤（OS）是一种侵袭性骨癌，肿瘤细胞间异质性高，许多患者预后不良。必须更好地理解驱动肿瘤生长、扩散和治疗耐药的因素，以确定新的生物标志物和治疗靶点。在本研究中，研究人员探讨了卷曲类受体4在OS进展中的作用，尤其是其与癌细胞干细胞样特性和迁移的关系。利用单细胞分析、临床样本和实验室实验，研究人员发现卷曲类受体4（FZD4）在OS中高表达，并与不良预后相关。降低其表达可减弱OS细胞的干细胞样特征和迁移能力。本研究还表明，miR-424-5p可通过靶向FZD4调控这些促肿瘤效应。这些发现可能有助于研究人员开发预测预后和治疗OS的新策略。

摘要
背景/目的：OS以显著的肿瘤异质性、干性相关表型、转移潜能和不良预后为特征。FZD4是参与干细胞调控和肿瘤进展的重要Wnt信号受体，但其在OS中的作用及microRNA介导的调控机制仍不清楚。本研究旨在探讨FZD4表达、OS干性、恶性进展及上游microRNA调控之间的关系。方法：使用Seurat、CytoTRACE和Monocle2分析人类OS单细胞RNA测序数据。评估肿瘤细胞亚群、发育潜能和伪时间轨迹。进行功能富集分析以确定与FZD4高表达相关的通路。使用MicroRNA-mRNA相互作用分析预测上游调控microRNA，并通过免疫组织化学、Western blotting以及体外和体内实验进行验证。结果：FZD4主要在OS肿瘤细胞亚群中富集，并与不良预后显著相关。FZD4高表达的肿瘤细胞表现出更高的发育潜能、干性特征以及早期发育状态的富集。功能富集分析表明上皮-间质转化、血管生成、炎症反应、KRAS信号传导、缺氧、糖酵解和Wnt相关通路被激活。临床验证证实OS组织中FZD4、OCT4和SOX2表达升高。FZD4敲低抑制了OS细胞的干细胞样表型和恶性行为、增殖和迁移，而miR-424-5p通过靶向FZD4抑制了这些恶性表型。重要的是，拯救实验表明，恢复FZD4表达可显著逆转miR-424-5p模拟物对成球能力、迁移/侵袭、增殖和干性相关细胞群体的抑制作用。结论：研究结果确定miR-424-5p是FZD4的上游抑制因子，并证明miR-424-5p/FZD4轴至少部分通过Wnt/β-catenin信号传导调控OS细胞的干细胞样和恶性表型。该轴可能代表OS的潜在治疗靶点。

# 论文解读：miR-424-5p通过靶向FZD4调控骨肉瘤干细胞样和恶性表型

## 研究背景与目的

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是青少年和年轻成人中最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有侵袭性强、早期转移倾向高和预后不良的特点。尽管化疗、靶向治疗和免疫治疗取得了进展，复发性和转移性OS的预后仍不理想。因此，识别参与OS进展的新型分子机制对于改善患者预后至关重要。

肿瘤异质性和癌症干性日益被认为是导致OS进展、转移和治疗耐药的关键因素。癌症干细胞样细胞具有强大的自我更新能力和未分化表型，从而促进肿瘤复发和治疗失败。单细胞转录组测序技术的进步为探索肿瘤异质性和识别干性相关肿瘤细胞亚群提供了有力工具。

MicroRNA是短的非编码RNA，在转录后水平调控基因表达，参与增殖、凋亡、干性和肿瘤进展等多种生物学过程。越来越多的证据表明，失调的microRNA通过调节致癌信号通路和干性相关程序促进OS进展。然而，microRNA介导的调控与OS中FZD4表达之间的关系仍不清楚。

Wnt信号通路是胚胎发育、干细胞维持和肿瘤进展的重要调节因子。卷曲受体（Frizzled receptors）是Wnt配体的关键受体，调节参与增殖、迁移、分化和干性的多个下游信号通路。FZD4与多种癌症中的血管生成和肿瘤进展相关。然而，FZD4在OS中的生物学作用及其上游microRNA介导的调控机制仍知之甚少。

本研究通过整合单细胞转录组分析、CytoTRACE分析、伪时间轨迹分析、microRNA调控网络分析以及临床样本和体外/体内实验验证，探讨FZD4在OS中的作用。研究结果表明FZD4与OS的干性相关特征、迁移和microRNA介导的调控网络相关。

## 主要技术方法

研究人员使用了公共数据库来源的GSE152048数据集（包含11例OS患者样本）和UCSC Xena数据库的88例OS患者mRNA测序数据及临床信息。利用Seurat包进行单细胞RNA测序数据处理，通过inferCNV区分恶性OS细胞，采用CytoTRACE2预测细胞干性，使用Monocle2进行伪时间轨迹分析，运用CellChat进行细胞间通讯分析，结合starBase数据库预测靶向FZD4的上游microRNA。验证实验使用了临床OS组织样本（n=5）和正常骨组织样本（n=4）进行免疫组织化学和Western blot分析，并在143B、HOS、MG63和U2OS等OS细胞系以及BALB/c裸鼠异种移植模型中进行功能实验验证。

## 研究结果

### 3.1 单细胞转录组分析揭示OS细胞异质性和发育潜能差异

通过单细胞转录组测序分析，研究人员鉴定了OS肿瘤微环境中的多种细胞群体，包括OS细胞、肿瘤相关巨噬细胞、成纤维细胞、破骨细胞、NK/T细胞、内皮细胞和周细胞。OS细胞被进一步重新聚类为8个转录组不同的亚群（C1-C8），表现出显著的瘤内异质性。CytoTRACE2分析显示不同OS细胞亚群之间的发育潜能存在显著差异，其中C3、C4以及部分C5/C6群体表现出较高的潜能评分和相对较低的分化状态，而C7和C8则表现出更多的分化特征。

### 3.2 FZD4与OS细胞的发育潜能和干性特征密切相关

相关性分析显示C1-C4细胞群体具有较高的转录组相似性，而C7和C8表现出独特的转录谱。Hallmark通路富集分析发现，高发育潜能的细胞群体显著富集于缺氧、TNFα信号传导、PI3K-AKT-mTOR信号传导、上皮-间质转化和炎症反应等促肿瘤通路。FZD4在具有较高发育潜能的特定OS细胞亚群中优先富集，FZD4富集的细胞群体表现出增加的干样转录特征。伪时间轨迹分析显示FZD4高表达细胞主要分布在未分化状态，而FZD4低表达细胞富集在分化程度更高的区域。

### 3.3 FZD4和干性相关分子在OS组织中高表达

免疫组织化学染色显示OS组织中FZD4、OCT4和SOX2的阳性信号强于正常骨组织。Kaplan-Meier生存分析表明FZD4高表达与较差的总生存期相关，但TARGET-OS训练队列中FZD4的HR为3.435（95% CI，0.151-78.169），置信区间很宽，应视为探索性关联而非独立预后因素。qPCR和Western blot分析进一步证实了肿瘤组织中FZD4、OCT4和SOX2在mRNA和蛋白水平的表达升高。

### 3.4 FZD4促进OS细胞的干性维持和未分化表型

qPCR结果显示FZD4在OS细胞系中高表达，其中HOS细胞表达最高。成球实验表明OS细胞球体随着培养时间的延长逐渐增大，富集的细胞球中FZD4、OCT4和SOX2表达水平显著上调。FZD4过表达增加了干性相关细胞比例、球体大小和Transwell迁移/侵袭能力。相反，FZD4敲低显著降低了OCT4和SOX2的表达，损害了成球能力，并减弱了Transwell迁移/侵袭能力和伤口愈合迁移率。

### 3.5 miR-424-5p靶向调控FZD4抑制OS细胞干性和恶性进展

miRNA测序分析结合STARBASE数据库预测，鉴定miR-424-5p、miR-30a和miR-196a-5p为FZD4的潜在上游调控miRNA。验证显示miR-424-5p在FZD4过表达细胞球中显著降低。FISH实验证实miR-424-5p和FZD4在细胞中共定位，双荧光素酶报告基因实验确认miR-424-5p可直接结合FZD4的3'UTR区域。miR-424-5p模拟物显著降低了FZD4、OCT4和SOX2的表达，并抑制了成球能力、Transwell迁移/侵袭能力和伤口愈合能力。

### 3.6 不同OS细胞亚群的功能富集和细胞间通讯分析

GO富集分析显示分支相关基因主要富集于细胞外基质组织、细胞迁移、血管生成、炎症反应和干性相关生物学过程。KEGG富集分析显示差异基因与PI3K-AKT信号传导、黏着斑、细胞因子介导的信号传导和ECM-受体相互作用等多个促肿瘤通路密切相关。细胞间通讯分析显示OS细胞与成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞之间存在广泛的配体-受体相互作用，其中MIF、TNF、TGFβ和CXCL信号通路在细胞间通讯中显著活跃。

### 3.7 FZD4和miR-424-5p在体内调节OS肿瘤发生和肺转移

体内成像显示sh-FZD4组的荧光信号较CON组显著减弱，表明肺转移受到抑制。皮下成瘤实验显示sh-FZD4组的肿瘤体积和重量均显著低于CON组，肺组织染色显示CON组有明显转移灶而sh-FZD4组肺转移显著减少。miR-424-5p模拟物治疗后，裸鼠体内荧光信号显著减弱，肿瘤体积和重量显著降低，肺转移灶明显减少。

### 3.8 FZD4恢复逆转miR-424-5p对OS细胞干样和恶性表型的抑制作用

拯救实验显示，在miR-424-5p模拟物处理的OS细胞中恢复FZD4表达可显著逆转miR-424-5p对迁移/侵袭能力、成球能力、细胞增殖和干性相关细胞群体的抑制作用。Western blot分析显示miR-424-5p模拟物降低了FZD4、β-catenin、OCT4和SOX2的表达，而FZD4恢复可显著恢复β-catenin、OCT4和SOX2的表达。免疫荧光分析进一步支持FZD4恢复后β-catenin信号的相应恢复。

## 讨论与结论

本研究系统证明了FZD4是OS中与干性相关的致癌调节因子。FZD4富集于具有高发育潜能的OS细胞亚群中，并促进干性维持、迁移、侵袭、肿瘤发生和肺转移。机制上，miR-424-5p通过直接靶向FZD4并抑制其表达，从而抑制FZD4介导的恶性表型。研究还发现FZD4相关的OS细胞状态可能与不同的肿瘤-微环境通讯模式相关，但CellChat分析属于推断性分析，应视为假设生成而非直接证据。此外，干性相关实验主要支持干样表型，仍需连续成球、有限稀释和肿瘤起始实验来最终确定癌症干细胞特性。

本研究存在一些局限性。研究使用的实验模型范围有限，需要更多分子异质性OS细胞系和患者来源模型进一步验证。关于Wnt信号通路的具体下游成分仍未完全阐明，需要β-catenin特异性抑制、TCF/LEF转录活性和下游Wnt靶基因分析等进一步实验加以描绘。更大的独立临床队列需要用来确定FZD4是否具有独立预后价值。基于miR-424-5p的治疗策略的安全性和临床可行性也需要进一步研究。

研究结论指出，该研究将FZD4确定为与OS细胞发育潜能和干样表型相关的重要调节因子。miR-424-5p直接靶向FZD4 3'UTR并抑制FZD4表达。拯救实验表明，恢复FZD4表达可显著逆转miR-424-5p对成球、增殖、迁移/侵袭和干性相关表型的抑制作用。这些效应伴随着β-catenin、OCT4和SOX2的相应变化，支持FZD4相关Wnt/β-catenin信号通路的参与。总的来说，这些发现确立了FZD4作为miR-424-5p在OS细胞中活性的重要功能介质，为将miR-424-5p/FZD4轴作为潜在治疗靶点的进一步研究提供了更强的机制基础。该研究发表在《Cancers》期刊上。