CoFe2O4改性生物炭与暴露于土霉素的垂直流人工湿地中微生物群落和抗生素抗性基因谱的关系

《Microorganisms》：CoFe2O4-Modified Biochar Is Associated with Microbial Community and Antibiotic Resistance Gene Profiles in Vertical Flow Constructed Wetlands Exposed to Oxytetracycline

　　

抗生素在水环境中的广泛存在引发了对抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）传播的担忧。尽管垂直流人工湿地（vertical flow constructed wetlands，VFCWs）能够高效去除废水中的抗生素，但基质构型、微生物群落与ARG丰度之间的关系仍知之甚少。本研究构建了五种不同基质构型的实验室规模VFCWs，包括钴铁氧体（CoFe₂O₄）改性生物炭及其与沸石的复合材料，并使用添加了土霉素（oxytetracycline，OTC）的合成生活污水进行评估。CoFe₂O₄改性增加了生物炭的比表面积和孔体积，并改变了其吸附行为。所有VFCWs均实现了较高的OTC去除率（>97%），尽管OTC在基质中的积累量存在差异。相比之下，ARG和可移动遗传元件（mobile genetic elements，MGEs）的丰度以及细菌群落特征在不同反应器间存在差异。tetA和tetX的总丰度范围为2.55 × 10²至1.90 × 10⁵ copies g^?1，其中CoFe₂O₄改性生物炭-沸石反应器显示出最低的平均ARG丰度。探索性共现分析确定了Acinetobacter与tetA以及Flavobacterium与tetA和tetX的关联（名义Spearman p < 0.05），尽管这些相关性并不能确定ARG宿主身份或水平基因转移。总体而言，研究结果表明，即使抗生素去除效率相当，与ARG丰度相关的微生物生态模式在不同VFCWs之间也可能存在差异。

**论文解读：CoFe₂O₄改性生物炭对垂直流人工湿地微生物群落与抗生素抗性基因谱的影响**

**一、研究背景与科学问题**

抗菌素耐药性（antimicrobial resistance，AMR）已成为全球公共卫生面临的最严峻挑战之一。水环境作为抗生素耐药细菌（antibiotic-resistant bacteria，ARB）、抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）和可移动遗传元件（mobile genetic elements，MGEs）的重要储库，其在抗性传播中的作用日益受到关注。抗生素在人类医疗、畜禽养殖和水产养殖中的广泛使用，导致其持续进入废水处理系统。即使在亚抑制浓度下，残留的抗生素仍可对微生物群落施加选择压力，促进耐药决定因子的持久化和传播。因此，废水处理系统不再仅仅被视为污染物去除的设施，而是能够影响ARGs及其微生物宿主环境归趋的复杂微生物生态系统。理解处理技术如何影响这些微生物生态过程，对于评估其在缓解抗菌素耐药性方面的贡献至关重要。

人工湿地（constructed wetlands，CWs）因其将物理过滤、吸附、植物吸收和微生物介导的降解整合在单一工程生态系统中，已成为可持续且经济有效的废水处理技术。其中，垂直流人工湿地（vertical flow constructed wetlands，VFCWs）具有改善的氧传递能力，已被证明对营养物质、有机污染物和多种抗生素具有较高的去除效率。然而，仅凭污染物去除效率只能部分反映处理性能。已有研究报告了抗生素浓度的显著降低伴随ARG丰度的下降，而另一些研究则观察到尽管污染物去除高效，ARGs仍持续存在甚至富集。这些相互矛盾的观察结果表明，微生物生态响应不能直接从抗生素去除效率推断，由此引出一个基本问题：具有相当抗生素去除效率的人工湿地是否可能在微生物生态性能上存在差异？解答这一问题需要更好地理解人工湿地中微生物群落组装和ARG丰度的控制因素。

有助于解释这些不同微生物生态结果的一个因素是湿地基质。基质不仅提供结构支撑，还充当工程化微生物栖息地，调节生物膜发育、氧气可利用性、营养梯度和微生物定殖，同时控制污染物吸附。因此，改性基质理化性质可能独立于整体污染物去除而改变微生物群落组装和ARG丰度。生物炭因其多孔结构、高比表面积和良好的吸附特性而作为湿地基质受到广泛关注。近年来，利用金属氧化物改性生物炭以进一步增强其理化性质的研究逐渐兴起。其中，钴铁氧体（CoFe₂O₄）具有高化学稳定性、磁回收性和丰富的表面活性位点，是环境修复中颇具前景的改性材料。尽管CoFe₂O₄改性材料作为抗生素及其他有机污染物去除的吸附剂已被广泛研究，但其在运行的VFCWs中对微生物群落组成和ARG丰度的影响却鲜少受到关注。

本研究旨在评估实验室规模VFCWs中基质构型与抗生素去除和微生物生态特征的关系。研究人员假设CoFe₂O₄改性不一定会提高整体OTC去除率，而可能与基质内OTC积累、微生物群落组成以及四环素类抗性基因和MGEs丰度的差异相关。通过共同考虑污染物去除和微生物生态终点，本研究为评估人工湿地中缓解抗生素耐药性的基质辅助策略提供了更广泛的基础。

**二、主要研究内容与结论**

研究人员构建了五种不同基质构型的实验室规模VFCWs，包括砾石（CW-LS）、沸石（CW-F）、生物炭（CW-C）、生物炭-沸石混合物（CW-CF，1:2，w/w）和CoFe₂O₄改性生物炭-沸石混合物（CW-GCF，1:2，w/w）。所有湿地均种植香蒲（Typha spp.），接种来自郑州污水处理厂的厌氧污泥，并以添加OTC的合成生活污水连续运行32天，分为三个逐步增加OTC浓度的阶段（100、200和500 μg L^?1）。研究人员首先通过批量吸附实验表征了CoFe₂O₄改性对生物炭理化性质和OTC吸附行为的影响，随后在VFCWs运行结束后测定了各层基质中的OTC积累量、ARGs和MGEs丰度，并通过16S rRNA基因扩增子测序分析了微生物群落组成，最后通过共现网络分析探索了ARGs、MGEs与微生物类群之间的潜在关联。

研究发现，CoFe₂O₄改性显著改变了生物炭的理化性质。扫描电子显微镜（SEM）显示改性后生物炭表面更为粗糙，颗粒分布更不均匀。氮气吸附-脱附等温线分析表明，CoFe₂O₄改性生物炭的比表面积从8.53 m² g^?1增加到14.01 m² g^?1，总孔体积从0.040 mL g^?1增加到0.056 mL g^?1，平均孔径从18.58 nm减小到16.02 nm。吸附动力学和等温线实验进一步表明，CoFe₂O₄改性生物炭对OTC的平衡吸附容量更高，且吸附行为从Langmuir型（R² = 0.990）转变为Freundlich型（R² = 0.993），表明改性后材料表面异质性增加，吸附位点分布更广。

**三、主要研究结果**

**3.1 CoFe₂O₄改性改变了生物炭的理化性质及OTC吸附行为**

扫描电子显微镜和BET分析结果表明，CoFe₂O₄改性增加了生物炭的比表面积和孔体积，降低了平均孔径，并使表面更加粗糙和异质化。吸附动力学和等温线拟合结果显示，改性生物炭的吸附行为从原始生物炭的Langmuir型转变为Freundlich型，表明吸附位点异质性增加。

**3.2 OTC去除效率与基质内积累量的差异**

所有五种VFCWs在整个32天运行期间均保持了稳定的高OTC去除效率（>97.16%，平均99.43 ± 0.15%），五种基质构型间无显著差异。然而，基质内的OTC积累量在不同反应器间存在明显差异。CoFe₂O₄改性生物炭-沸石反应器显示出最高的平均OTC积累量，其中上部和中部基质层浓度最高；生物炭反应器次之；而生物炭-沸石反应器的积累量最低。这一结果表明，尽管各基质构型对水相中OTC的去除效果相当，但OTC在湿地基质中的滞留行为存在显著差异。

**3.3 ARGs和MGEs丰度在不同VFCWs间的差异**

定量PCR分析显示，各VFCWs中tetA和tetX的绝对丰度范围为2.55 × 10²至1.90 × 10⁵ copies g^?1，均在上部基质层中最高。平均绝对ARG丰度按砾石 > 生物炭 > 沸石 > 生物炭-沸石 > CoFe₂O₄改性生物炭-沸石的顺序递减；平均相对丰度按砾石 > 生物炭 > 沸石 > CoFe₂O₄改性生物炭-沸石 > 生物炭-沸石的顺序递减。MGEs（intI1、intI2和ISCR1）的垂直分布模式类似，其中intI1通常丰度最高。

**3.4 微生物群落组成在不同VFCWs间的差异**

16S rRNA基因扩增子测序共获得384,863条高质量序列，注释到36个细菌门和745个属。生物炭反应器显示出最高的α多样性（Chao1 = 1701.3，Shannon = 8.41），而砾石反应器最低（Chao1 = 821.8，Shannon = 5.30）。在门水平上，Proteobacteria、Bacteroidota和Patescibacteria为优势门，但其相对丰度在不同反应器间存在差异。LEfSe分析显示，CoFe₂O₄改性生物炭-沸石反应器中Proteobacteria较为突出，砾石反应器中Bacteroidota较为突出，而生物炭反应器中Patescibacteria较为突出。

**3.5 共现网络分析揭示的潜在关联**

共现网络由32个节点和99对满足名义Spearman标准（p < 0.05）的相关性构成，模块度为0.46。分析表明，intI1与包括Thauera和Endomicrobium在内的多个菌属呈正相关；Acinetobacter与tetA呈正相关而与intI1呈负相关；Flavobacterium与tetA和tetX均呈正相关；tetA与tetX之间也呈正相关。需要强调的是，这些关联仅为探索性的共变关系，不构成ARG宿主身份或水平基因转移的证据。

**四、讨论与结论**

本研究发现，尽管所有VFCWs均实现了较高的OTC去除效率，但不同基质构型在OTC积累、ARGs和MGEs丰度以及微生物群落组成方面存在显著差异。CoFe₂O₄改性生物炭-沸石反应器显示出最高的OTC滞留量却具有最低的平均ARG丰度，这一看似矛盾的现象可能归因于多种机制的共同作用。增强的吸附能力可能降低了OTC在基质中的生物可利用部分，从而减轻了抗生素选择压力；生物炭基材料可能吸附胞外DNA，减少细胞外ARGs的持久性和水平基因转移机会；此外，CoFe₂O₄在适当环境条件下可能产生活性氧物种，影响细菌活性和ARGs持久性。然而，这些机制在本研究中未被直接测量，应视为可检验的假设而非已证实的机制。

研究表明，抗生素去除与ARGs消减之间存在解耦现象。常规污染物去除指标可能无法完全反映处理系统内ARG谱系的差异，将ARG丰度、MGE丰度和微生物群落组成等微生物生态终点作为人工湿地性能的补充评估指标具有重要意义。本研究的局限在于每种基质构型仅由单个VFCW反应器代表，缺乏反应器级重复，因此观察到的差异不能解释为统计学上已确立的处理效应。未来研究应结合独立重复的湿地系统，直接测量抗生素生物可利用性和微生物选择压力，同时采用宏基因组学、宏转录组学和长期现场验证，以阐明本研究所观察到的模式背后的功能关系，从而确定基质工程能否在维持高效抗生素去除的同时减少人工湿地中抗生素耐药性持久化和传播的相关条件。