《SCIENCE ADVANCES》：A newly established reverse genetic system for a circular RNA virus reveals new requirements for infection and its biocontrol potential
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双义病毒（ambivirus）是一类感染真菌的环状单链RNA病毒，独特地兼具类病毒（viroid）与病毒特征，然而其保守ORF-B编码蛋白的功能及对宿主的影响尚不清楚，这受制于缺乏反向遗传学系统。研究人员利用置于真菌启动子下游的头对尾二聚体，构建了首个双义病毒
双义病毒（ambivirus）是一类感染真菌的环状单链RNA病毒，独特地兼具类病毒（viroid）与病毒特征，然而其保守ORF-B编码蛋白的功能及对宿主的影响尚不清楚，这受制于缺乏反向遗传学系统。研究人员利用置于真菌启动子下游的头对尾二聚体，构建了首个双义病毒禾谷镰刀菌双义病毒1（Fusarium graminearum ambivirus 1, FgAV1）感染性cDNA克隆。FgAV1通过菌丝融合（hyphal anastomosis）水平传播至无病毒禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）菌株。值得注意的是，反向取向的二聚体构建体同样具有感染性且可传播。靶向诱变揭示，ORF-A与ORF-B编码蛋白以及内嵌核酶（ribozyme）的存在均为双义病毒复制所不可或缺。研究人员结果进一步表明，FgAV1感染触发真菌RNA干扰（RNAi）响应，将宿主小RNA（sRNA）的抗病毒作用扩展至环状RNA病毒。此外，FgAV1感染抑制真菌生长并显著降低禾谷镰刀菌在小麦上的毒力。这些发现为双义病毒复制机制及其在真菌病原生物防治中的潜力提供了新见解。
研究背景与立项依据：RNA世界假说认为RNA早于DNA与蛋白质出现。RNA病毒中，Ribozyviria界由宿主DNA依赖RNA聚合酶（DdRP）反式复制，Riboviria界编码RNA依赖RNA聚合酶（RdRP）。真菌病毒（mycovirus）多样性极高，其中双义病毒（ambivirus）属Ambiviricota门，具约4.3–5.2 kb环状ssRNA基因组，含ambisense排列的ORF-A（疑似RdRP）与ORF-B（功能未知、高度保守），以及正、负链各一个功能性核酶（ribozyme），提示对称滚环复制。既往研究多依赖宏转录组，缺乏反向遗传学系统，ORF-B是否翻译、核酶是否必需、感染表型如何均无定论。部分真菌病毒（如CHV1）可致低毒力（hypovirulence）并用于生物防治，但双义病毒对禾谷镰刀菌（引起小麦赤霉病FHB及DON毒素）的影响未明。本研究以FgAV1为模型建立首套双义病毒反向遗传学系统，界定复制必需元件并评估其生防潜力。论文发表于《SCIENCE ADVANCES》。
主要关键技术方法：以无病毒禾谷镰刀菌Fg1731（意大利Cadriano硬粒小麦分离）为受体，天然带毒菌株Fg266 MV（德国Pocking玉米穗分离）为序列来源；构建pHX9-nv载体（含粗糙脉孢菌gpd-1启动子/终止子及hph筛选标记）下的单体、正向头对尾二聚体、反向二聚体及系列突变体（ΔAUG-ORF-B、ΔRz、ΔGDD-ORF-A、锤头核酶核心A缺失），PEG介导原生质体转化；以DNase I处理总RNA排除质粒污染，链特异性DIG核糖探针Northern blot检正负链线性/环状RNA；菌丝共培养28天评水平传播；Illumina sRNA测序（bowtie比对二聚参照）析RNAi响应；AlphaFold3预测ORF-B结构、Foldseek比对PDB/BFVD；硬粒小麦（cv Irode）穗部接种测毒力，McKinney指数评病级，并测菌丝生长、产孢与DON。
研究结果
Assembly of an infectious cDNA clone of FgAV1：单体构建体不复制，正向头对尾二聚体转化Fg1731后Northern blot检出正负链线性及环状4579 nt形式，证实首例双义病毒感染性cDNA克隆建立。
Reverse-oriented dimer cDNA clone can initiate FgAV1 replication：反向二聚体亦产出正负链RNA，复制模式与正向无异；ΔGDD-ORF-A突变不复制，证明ORF-A RdRP不可缺，反向感染性源于宿主转录机器识别隐蔽启动子而非放弃ORF-A功能。
Translation of ORF-B is required for FgAV1 replication：AlphaFold3示ORF-B具X/Y/W/Z高置信域，Y含RRM样折叠（92–144），W（280–409）似RdRP palm但无催化D残基。删ORF-B起始AUG（正向/反向二聚体）均废复制与传播，证ORF-B翻译非冗余必需。
Ribozyme structures are essential for FgAV1 replication：删双核酶或锤头核酶核心A缺失皆阻断复制与传播，实验确证核酶为加工环状基因组的功能性必需元件而非结构装饰。
Horizontal transmission of FgAV1 via hyphal anastomosis：正向/反向二聚体供体与Fg1731共培养，受体经三代转移无hph仍RT-PCR/Northern阳性，证经菌丝融合水平传播；跨镰刀菌属及木霉属转化不复制，宿主范围窄。
FgAV1 infection may trigger a host RNA interference (RNAi) response：sRNA测序得149432条病毒映射读长，峰值21 nt，正负链近对称，5'端75%为U，热点分布于1–21、320–340、425–450、1850–1880、3695–3725位，符合真菌抗病毒RNAi特征，首次将sRNA沉默扩展至环状RNA病毒。
FgAV1 infection reduces fungal growth and virulence：带毒隔离株48 h/72 h菌落直径降14%/10%，菌丝延伸率降9%，产孢降32%；小麦穗接种病级降73%，千粒重升29%；DON在部分隔离株受抑。证FgAV1为低毒力因子。
讨论与结论浓缩：研究人员指出，该系统是Riboviria内首个环状RNA病毒感染性克隆（HDV属卫星不计入）。ORF-A（RdRP）、ORF-B（RRM样+RdRP palm样无催化残基，疑涉RNA结合/保护/解旋/环化辅助）、双核酶共同构成“蛋白+RdRP+核酶”混合复制模式，有别于典型病毒与类病毒。反向二聚体感染性揭示cDNA启动复制的取向柔性但不豁免ORF-A。FgAV1触发21 nt sRNA、5'U偏倚的RNAi压力下仍稳定传代，表型上抑生长/产孢/毒力，原理类比CHV1板栗疫病生防。遗留问题含ORF-B生化功能、反向启动机制、宿主限制因子。结论：研究建立双义病毒首套反向遗传学平台，确证ORF-A、ORF-B及核酶三者为复制不可缺，示FgAV1经菌丝融合传播、激发真菌RNAi、降低禾谷镰刀菌生长与小麦毒力，为环状RNA病毒复制机理与真菌病原生物防治提供理论与材料基础。
