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来那卡帕韦（Lenacapavir，LEN）是一种高效、长效的衣壳抑制剂，在HIV-1感染的治疗和预防方面展现出非凡前景。LEN会导致成熟病毒衣壳破裂并失去完整性，但其潜在机制此前尚不清楚。在本研究中，研究人员证明LEN是HIV-1衣壳结构的别构调节剂（all
来那卡帕韦（Lenacapavir，LEN）是一种高效、长效的衣壳抑制剂，在HIV-1感染的治疗和预防方面展现出非凡前景。LEN会导致成熟病毒衣壳破裂并失去完整性，但其潜在机制此前尚不清楚。在本研究中，研究人员证明LEN是HIV-1衣壳结构的别构调节剂（allosteric modulator），通过两步机制破坏衣壳的富勒烯锥体（fullerene cone）结构：首先在高曲率端点（declination）处发生破裂，随后衣壳主体出现裂隙。在分子水平上，LEN改变了衣壳亚基之间的非共价相互作用，并降低了局部晶格曲率。研究人员提出了一个应力-应变模型（stress-strain model）来阐释LEN如何重塑HIV-1衣壳结构，从而损害病毒的复制能力。
**LEN对HIV-1衣壳的裂解作用**
已发表的高分辨率LEN-衣壳相互作用结构研究仅依赖于可溶性的、二硫键稳定的HIV-1 CA六聚体或体外CA组装体。相比之下，研究人员对从病毒粒子中纯化的真实病毒衣壳进行了分析。研究人员首先使用电子显微镜（EM）检查LEN如何影响衣壳的整体形态，以与基于荧光的及其他成像研究建立关联。值得注意的是，单分子成像研究表明，LEN诱导的衣壳破裂取决于可用结合口袋的占用率（每个衣壳平均约1200个）；而占用率的累积又取决于LEN浓度。因此，研究人员在低和高药物浓度下检查了LEN诱导的破裂。
为了检查低浓度下的LEN效应，研究人员使用了5 nM LEN，这是该药物的EC95值，近似于皮下给药24周后的药物血浆浓度。为了保持LEN过量，研究人员将纯化的病毒核心稀释至约1 nM CA（在约0.5升缓冲液中）。为了便于EM观察，核心通过结合到离子交换树脂上再浓缩、洗脱，然后进行负染EM处理。与LEN孵育1小时后，研究人员发现几乎所有观察到的衣壳都已经破裂，这通过衣壳壁投影图像中的清晰间隙得以证实。这些早期间隙位于含有五聚体的端点处或附近。在更长的孵育时间（4和8小时）下，衣壳出现更多裂缝和更宽的间隙。衣壳壁也日益变平。在所有时间点，用二甲基亚砜（DMSO）对照孵育时，观察到超过90%的核心保留了明显完整的衣壳，这支持了观察到的衣壳形态变化可归因于LEN的推断。这些结果与先前研究的观察结果很好地吻合。在5 nM LEN下，使用已发表的结合和解离速率常数计算的结合曲线预测，药物占用率在1小时时将达到约60%，在4小时时达到≥95%。总之，这些数据表明衣壳损伤分两个阶段发生，且与LEN占用率相关：低占用率时端点发生损伤，高占用率时衣壳主体发生后续损伤。
接下来，研究人员在高浓度（5至10 μM CA）下用约10倍过量的LEN孵育核心。在这些条件下，预计在1至2分钟内即可达到完全占用。核心浓度足够高，可通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）成像。同样，所有观察到的衣壳都破裂了，端点缺失，壁变平，与用5 nM LEN孵育4至8小时的核心形态特征相同。在该实验中，可以通过直接计数来量化核心。结果表明，经LEN处理和未经LEN处理的核心数量相似。这与预期一致，即LEN不会诱导整体衣壳解体，而是使衣壳破裂并产生稳定的残余物。
研究人员使用电子冷冻断层扫描和亚断层扫描平均晶格作图来可视化衣壳残余物的三维（3D）组织。由于这种方法倾向于低估晶格的完整性，研究人员最初将分析限制在晶格图仍勾勒出整体衣壳形状且保留了绝大多数亚基的核心上。研究人员发现，在投影图像中看似多个独立碎片的结构实际上构成了一个单一的残余物。最完整的晶格图证实端点大部分缺失，尽管个别五聚体仍然存在。最值得注意的是，衣壳主体被一条或多条可能贯穿其整个长度的裂隙所分割。这些裂隙勾勒出不同弧段——平坦或弯曲——的相对壁，使衣壳残余物看起来像一个受损的鞋子。
在确定了LEN损伤衣壳的关键特征后，研究人员能够分析完整数据集（共71个核心）。尽管71个中有8个因覆盖范围太有限而无法分析，但71个中有63个（89%）可以通过目视检查归类为外观相似的衣壳残余物的不完整晶格图。这些发现表明，尽管HIV-1衣壳具有极高的多形性，但破裂机制可能是相同的。
最后，研究人员确认LEN在通过组装纯化的重组CA蛋白获得的合成衣壳中也诱导相同的形态变化。这些结果表明LEN对衣壳的结构效应独立于核心的内容物。合成衣壳对LEN效应更具抵抗力，研究人员认为这是由于空衣壳中固有的应变较低。
总之，研究结果支持这样的发现：LEN并非对HIV-1衣壳具有整体稳定作用，而是破坏了富勒烯锥体结构。在药理学相关的LEN浓度下形成两种类型的断裂：（i）在较早时间点端点丢失，（ii）在较晚时间点衣壳壁出现裂隙。
**LEN改变CA六聚体结构**
为了确定LEN改变衣壳形态的分子机制，研究人员使用单颗粒平均冷冻电镜方法检查了经LEN处理和未经处理的衣壳中的CA衣壳粒结构。聚焦重构表明，LEN饱和的核心主要包含六聚体，其平均结构解析到标称分辨率2.8 ?。不对称单元中的药物密度与周围侧链具有相同的清晰度，确认了六聚体中所有六个可能的结合位点均完全占用。研究人员还从未结合的核心中解析了平均CA六聚体结构，标称分辨率为2.9 ?。坐标模型被精修到每个图中，以便在分子细节上比较两种结构。
未结合和LEN结合的六聚体模型作为完整六聚体的叠加显示它们非常相似，等效Cα原子的平均均方根偏差为1.5 ?。然而，位移矢量虽然很小，但具有非随机轨迹。这一结果表明LEN诱导CA六聚体结构发生微小但协调的变化，当在单个亚基水平上进行叠加时，这些变化变得更加明显。通过对这些叠加的系统分析，研究人员发现LEN改变了稳定六聚体的两个分子间接触位点处的CA亚基堆积，这两个位点称为NTD-NTD和NTD-CTD界面。在NTD-NTD界面，螺旋2与螺旋1和3的堆积因螺旋2的轻微旋转和平移（约1 ?）而改变。在NTD-CTD界面，CTD相对于NTD的方向改变了约8°，同时螺旋8的N末端和连接螺旋3和4的环也发生微小变化。LEN还改变了N末端β-发夹的构型。至关重要的是，这些变化发生在距离LEN结合位点15至30 ?远的远端位置，因此将LEN确定为HIV-1 CA六聚体的别构调节剂。
**LEN降低局部晶格曲率**
LEN结合在NTD-CTD界面，这是晶格曲率的关键决定因素。为了了解LEN如何影响晶格曲率，研究人员进行了以两个相邻六聚体为中心的聚焦重构。在这些图中，两个药物结合位点侧翼是连接两个六聚体的CTD-CTD二聚体界面。在比较LEN结合和未结合的图时，研究人员发现LEN诱导NTD向CTD方向旋转，因此侧翼的NTD彼此倾斜。在CA管中，据报道LEN结合稳定了连接六聚体的CTD-CTD二聚体，但在研究人员的结合和未结合图的比较中，二聚体结构基本不变。与CA管不同，在实际衣壳中CTD二聚体几乎不变，因为NTD-CTD界面的弯曲是衣壳主体晶格曲率的主要决定因素。
研究人员的共识图描述了结合和未结合衣壳中的总体平均曲率。为了更精确地量化LEN如何影响曲率，研究人员定义了每个都跨越较窄曲率范围的粒子子集。研究人员使用这些子集重建了15个图，然后量化了每个图中两个六聚体的相对方向，用倾斜和扭转角度表示。研究人员发现，在LEN结合的结构中，平均六聚体-六聚体倾斜减少了5.4°，这与衣壳表面相对变平一致。在LEN结合的衣壳中也观察到向更正扭转的转变。这些结果表明LEN诱导的别构变化不仅限于六聚体环内，也体现在六聚体之间。
先前的研究表明，HIV-1衣壳的曲率主要是由中央六聚体环中不对称的NTD-NTD堆积产生的，产生固有弯曲的CA六聚体。根据研究结果，该模型意味着LEN使六聚体对称化。研究人员通过使用弯曲六聚体作为初始模板并在重建未结合六聚体时不施加对称性来探索这种可能性，但这种方法仍然产生了接近六重对称的图。因此，即使在不存在LEN的情况下，HIV-1衣壳中的NTD-NTD相互作用已经是接近六重对称的，因此LEN诱导的曲率效应主要是通过NTD-CTD界面介导的。
**LEN占用率与六聚体-六聚体倾斜相关**
接下来，研究人员检查了导致端点丢失的早期断裂事件的分子基础；这些位点包含CA五聚体和具有最高局部曲率的六聚体。早期效应很有趣，因为预测LEN仅结合CA六聚体而非五聚体。LEN饱和的核心几乎不含五聚体，因此研究人员用亚饱和水平的药物（CA与LEN的比率为4：1）孵育核心。在这些条件下，仍然可以观察到明显完整的端点。研究人员能够对CA五聚体进行聚焦重构，但不幸的是无法达到高分辨率。为了达到更高分辨率，研究人员制备了等效的体外组装衣壳样品，并获得了以五聚体（3.5 ?）和与五聚体相邻的六聚体（3.4 ?）为中心的重构。两个图都表明五聚体中的五个潜在结合位点未与LEN结合。研究人员能够从空衣壳而非核心中解析五聚体到更高分辨率的事实表明，核心更容易受到LEN破裂的影响，大概是因为核心内容物诱导了衣壳应变，或者因为内容物阻止了衣壳适应药物结合诱导的应变。
与五聚体相邻的六聚体上的六个结合位点具有不同的LEN占用率（按顺时针方向编号）：最靠近五聚体的两个位点（位点1和2）分别具有高和低占用率；接下来相邻的两个位点（3和6）也很高，而最远的位点（4和5）为中等。研究人员通过重建以两个六聚体和一个五聚体的伪三重轴为中心的图并检查该图中两个不同的六聚体，进一步确认了这种高-低-高-中等-中等-高的模式。因此，在亚饱和药物水平下，衣壳表面上的LEN结合口袋并非等效地被LEN占用，至少在五聚体旁边的六聚体中如此。
与五聚体相邻的六聚体在整个富勒烯锥体中具有最高的局部倾斜，并且在其六个亚基中该角度也可能具有最大变化。因此，研究人员检查了LEN占用率与倾斜之间的相关性。由于LEN降低了局部曲率，研究人员很感兴趣地发现，具有最高倾斜（35°）的位点具有最高（位点6）或最低（位点2）的平均占用率。这两个位点侧翼是衣壳中倾斜度最高的六聚体-六聚体界面。位点1也具有高倾斜（31°）和高占用率，但该位点面向不能结合LEN的五聚体。研究人员的解释是，高倾斜界面容忍LEN在两个侧翼结合位点之一结合，但同时占用两个位点可能具有去稳定作用。
鉴于这些观察结果，研究人员检查了倾斜和占用率是否在位于锥体主体的六聚体中也相关。从聚焦于两个六聚体的共识图（3.8 ?）中，研究人员根据倾斜对粒子进行分类，然后重建高倾斜和低倾斜图（均为4.1 ?）以比较平均占用率。在这种情况下，研究人员发现低倾斜图具有显著高于高倾斜图的平均占用率。这一结果支持了研究人员的解释，即侧翼为低倾斜六聚体-六聚体界面的两个药物结合位点更可能同时被LEN占用。不幸的是，研究人员未能成功进行互补分析——按占用率对粒子进行分类以比较倾斜——因为药物质量相对于研究人员的图中的总质量而言太小。
**讨论**
在这里，研究人员表明LEN是HIV-1衣壳结构的别构调节剂，在近原子分辨率尺度上改变了CA亚基之间的非共价键相互作用，并在纳米尺度上使富勒烯锥体破裂。研究人员发现LEN别构调节衣壳结构，这与LEN结合在主要CA-CA相互作用的关键部位这一事实一致，该位置对六边形衣壳晶格的曲率决定、六聚体/五聚体转换以及宿主因子结合至关重要。
研究人员可以将结构观察结果合理化为一类应力-应变响应。研究人员提出，LEN结合在衣壳晶格上诱导应力，作为响应，组装的CA亚基调整它们之间的非共价相互作用——在六聚体内和六聚体之间——以局部适应应变。随着更多LEN分子结合，局部调整也累积到不再与完整富勒烯结构相容的程度，此时发生材料失效或衣壳破裂。在高（微摩尔）LEN浓度下，结合占用率和应力迅速上升，导致几乎立即失效。另一方面，研究人员在低（5 nM）LEN下观察到两种类型的失效：1小时内端点丢失（实验中的最早时间点）和4小时内锥体主体开裂。这一有趣的发现表明，富勒烯锥体不具有均匀的材料特性。相反，端点和衣壳主体对应力有不同的响应，并具有不同的失效阈值。在该模型中，端点具有较低的阈值，因此首先失效，这也可能释放了剩余衣壳上的整体应变。锥体主体可以承受更高的应变，因此需要更高的LEN占用率才能达到其失效阈值。与模型一致，计算机模拟也表明富勒烯锥体具有材料异质性，锥体末端（端点所在位置）比锥体主体具有更高的刚度。所有这些效应都是富勒烯锥体结构的结果，其中每个衣壳亚基都处于独特的环境中。
研究人员的结构数据进一步表明，对LEN结合的分子响应涉及CA晶格的局部变平。这一观察结果表明了为什么端点比衣壳主体具有更低断裂阈值的简单解释。该模型的关键是侧翼为六聚体-六聚体界面的两个药物结合位点的相对占用率。研究人员提出，两个位点同时占用是改变两个六聚体之间倾斜角所必需的。围绕五聚体的六聚体在富勒烯锥体中具有最高的局部曲率。因此，可以预期药物诱导的这些六聚体-六聚体倾斜角的变化将不被很好地容忍，这解释了端点的较低断裂阈值。所提出的两个位点同时结合的要求也与观察到的衣壳整体占用率与破裂行为之间的相关性一致。
单分子实验表明，衣壳破裂时LEN的占用率随LEN浓度的增加而增加。在低LEN下，破裂发生在20%至30%的平均占用率，研究人员现在将其解释为端点失效的阈值。在高LEN下，衣壳破裂时占用率升至约70%，研究人员将其解释为对应衣壳主体的失效。端点的较低断裂阈值可能与脱壳相关，脱壳是病毒复制步骤中衣壳打开以释放其基因组的步骤。
研究人员的另一个关键发现是，LEN从根本上改变了将衣壳维系在一起的非共价相互作用。虽然这些改变可以被合理化解释为LEN已确立的六方CA晶格稳定作用的基础，但研究人员提出更广泛的含义是它们也改变了衣壳作为材料的特性。一个可能的类比是冶金中的合金化，即将另一种元素与基底金属混合的古老做法。在合金中，引入的原子通常会改变金属键，并可能产生内应力，从而改变材料的特性及其对环境应力的响应方式。支持这一观点的是，研究人员对LEN处理的衣壳的晶格图显示具有清晰边缘的断裂，这表明材料具有脆性。用GS-CA1（一种LEN类似物）在逆转录过程中处理的衣壳也显示出脆性断裂。相比之下，在没有药物的情况下逆转录过程中破裂衣壳的晶格图显示出更多的塑性变形（即，它们不那么脆）。
LEN在单周期测定中的剂量反应曲线是双相的，PF74（一种相关但效力较低的化合物）也是如此。低浓度相（LEN为皮摩尔级）抑制感染高达10倍，随后是高浓度相（LEN为纳摩尔级），与逆转录抑制相关。药物与病毒粒子的预孵育增加了第二相的效力。研究人员在本研究中的结构观察，以及GS-CA1对纯化核心内源性逆转录的抑制，为LEN在第二相中的抑制与直接的药物诱导衣壳损伤相关的解释提供了进一步支持。
第一相中的药物活性分子基础仍有待解释，在该相中逆转录产物可以积累到正常水平。体外实验表明，在该浓度范围内，由于占用率的缓慢累积，衣壳破裂需要延长孵育时间。因此，尚不清楚该相中的药物活性是否也涉及衣壳破裂。研究人员提出，即使在LEN本身不足以破坏衣壳的占用率下，当其他应力因素叠加时，仍然可以达到破裂阈值。这种增强效应已在两种情况下观察到。首先，模拟表明核心的包装内容物诱导衣壳应变，研究人员在此发现核心比空衣壳更容易发生LEN诱导的断裂。其次，逆转录从内部对衣壳施加应力，GS-CA1在此过程中显著加剧了衣壳破裂。
衣壳脆性与HIV-1核输入有关，这是LEN在低浓度范围内抑制的复制步骤。在该步骤中受损的HIV-1 CA突变体形成脆性（非弹性）衣壳，恢复输入的补偿性突变也恢复了弹性。根据研究人员的模型，LEN诱导的脆性应使衣壳在通过核孔时承受应力时易于破裂，模拟支持这一预测。因此，衣壳晶格的互联特性、其富勒烯锥体结构、其机械特性以及与复制和核输入相关的应力共同作用，使衣壳易受LEN的别构抑制。
