《Biology》：Arabidopsis bZIP68 Modulates Flowering Time Potentially with Chromatin and Stress-Responsive Regulators
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在拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中，转录因子bZIP68的生理功能和调控网络仍知之甚少。为探究其潜在功能及调控组（regulome），研究人员整合了多个公开可用的组学数据集，包括蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein i
在拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中，转录因子bZIP68的生理功能和调控网络仍知之甚少。为探究其潜在功能及调控组（regulome），研究人员整合了多个公开可用的组学数据集，包括蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction, PPI）网络和共表达网络、bzip68突变体的转录组数据、bZIP68染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据，以及候选调控因子的ChIP-seq/DNA亲和纯化测序（DAP-seq）和转录组数据集。这些整合分析表明，bZIP68参与花器官形态建成、开花调控和非生物胁迫响应。值得注意的是，SWI3D、MINU2和CAMTA1被鉴定为bZIP68核心调控组（core regulome）的高度可能组分。随后的转录组网络分析揭示了它们推定的信号级联。为验证bZIP68在开花调控中的预测作用，研究人员分析了5个独立的纯合EMS突变体（homozygous EMS mutant, HEM）株系。与野生型相比，所有5个突变体株系均表现出改变的开花表型。总之，本研究建立了一个用于鉴定bZIP68调控网络的整合框架，并揭示了其在调控开花中的新生理功能。
**一、研究背景与科学问题**
在植物中，转录因子作为关键调控节点，介导了生长发育、胁迫响应及阶段转变等多种生理过程。拟南芥作为模式植物，其参考基因组质量高、基因注释完善，然而仍有大量转录因子的生理功能尚未被清晰注释，bZIP68即为其中之一。bZIP68最早被鉴定为氧化还原依赖性调控的碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）转录因子，此后的研究显示其参与光形态建成，并与GBF1和bZIP16存在功能冗余。然而，关于bZIP68是否参与开花时间调控，此前仅有一个等位突变体表现出晚花表型，而另一个等位突变体未表现出明显表型，证据较为薄弱且存在争议。此外，bZIP68在非生物胁迫响应中的具体角色及其调控网络仍不清晰。由于转录因子家族内部成员间存在功能冗余，单基因突变往往不表现明显表型，传统遗传学方法对这类基因的功能解析存在局限。因此，亟需采用系统性的多组学整合策略，从多维数据中挖掘bZIP68的潜在功能线索，并通过实验验证其生理角色。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员首先对bZIP68进行了系统发育分析，鉴定出18个种内同源基因，其中bZIP16为最相近的姊妹成员，GBFs家族也与bZIP68亲缘关系较近。同源基因已知功能暗示bZIP68可能参与光形态建成。随后，通过Protein–Protein Interaction（PPI）网络和共表达网络分析发现，bZIP68的相互作用组和共表达网络成员富集于脱落酸信号通路、盐胁迫响应、渗透胁迫响应、根系发育、种子萌发调控及免疫应答等生物学过程。对bzip68突变体转录组数据的重分析鉴定出205个差异表达基因，功能富集分析显示其涉及非生物胁迫、光响应、花器官身份维持及防御响应等通路。对bZIP68 ChIP-seq数据的分析鉴定出24个高置信度直接靶基因，其中非生物胁迫和花发育相关基因显著富集。进一步的调控组鉴定中，研究人员分析了1,435个公共ChIP-seq和DAP-seq数据集，确定了72个推定调控组成员。通过比较bzip68突变体与各调控组成员突变体的转录组关联度，最终将CAMTA1、MINU2和SWI3D定义为核心调控组。基于核心调控组的共差异表达基因分析鉴定出323个共享DEGs，GENIE3调控网络分析进一步解析出多个调控模块。最终，研究人员分析了5个携带bZIP68基因区独立突变的纯合EMS突变体株系，在长日照条件下全部表现出开花时间改变并伴随花器官形态异常，以生理学证据支持了bZIP68在开花调控中的新功能。
**三、关键技术与方法**
本研究采用的主要技术方法包括：（1）系统发育分析，利用BLASTp鉴定同源蛋白，MAFFT比对后以IQ-TREE构建系统发育树；（2）网络分析，基于GeneMania构建PPI与共表达网络，DAVID进行Gene Ontology（GO）富集；（3）转录组分析，对385个公共RNA-seq数据集进行统一处理与差异表达分析，并以Spearman等级相关计算转录组关联分数；（4）ChIP-seq与DAP-seq整合分析，对1,435个公共数据集进行峰重叠比较，鉴定共定位的候选调控因子；（5）突变体表型分析，对5个独立HEM株系进行开花时间与花形态观察。样本来源均取自公共数据库及拟南芥Col-0背景的HEM突变体系。
**四、研究结果**
**1. bZIP68相互作用组与共表达基因网络的鉴定**
系统发育分析表明bZIP68与bZIP16和GBFs成员亲缘关系最近。PPI网络分析鉴定出53个相互作用组成员，GO分析显示其富集于脱落酸信号通路、囊泡介导转运、盐胁迫响应及种子萌发调控等功能。共表达网络包含38个成员，富集于低氧应答、蓝光响应及大孢子发生等过程。
**2. bZIP68转录组与ChIP-seq分析**
主成分分析显示bzip68突变体与野生型转录组图谱存在明显分离。205个DEGs的功能富集分析揭示了非生物胁迫、光响应及果实成熟等相关通路。24个直接靶基因的GO分析显示非生物胁迫和花发育相关基因高度富集。
**3. bZIP68功能概要**
空间表达谱分析表明，bZIP68在衰老叶片和角果中优势表达，根中表达量相对较高。转录组关联分析未发现与bzip68突变体高度相关的特定环境或胁迫条件，暗示bZIP68功能可能更偏向成株期而非种子萌发阶段。
**4. bZIP68调控组的鉴定**
对ChIP-seq和DAP-seq数据的系统比较分析鉴定出72个推定调控组成员，其中57个为转录因子，15个为表观遗传因子。调控组靶基因富集于非生物胁迫和花发育相关功能。11个调控组成员基因（如CCA1、CBF1、CBF3等）在bzip68突变体中表达发生改变。
**5. bZIP68核心调控组的鉴定及基因调控网络**
CAMTA1、MINU2和SWI3D被定义为核心调控组（关联分数>0.4）。323个共享DEGs的GO分析显示富集于非生物胁迫、韧皮部和木质部组织发生及防御响应等过程。GENIE3分析鉴定出13个调控模块，其中6个含超过7个强调控节点，模块基因功能富集于非生物胁迫响应和防御响应。
**6. bzip68突变体的花发育相关表型**
5个携带独立突变的HEM株系在长日照条件下均表现出开花时间改变并伴随花器官形态异常，以独立重复的遗传学证据验证了生物信息学预测的bZIP68开花调控功能。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，核心调控组成员与bZIP68的关联来自转录组的整体方向性趋势而非大量共享DEGs，因此核心调控组应视为推定的调控网络而非已确认的直接调控因子。bZIP68可能与SWI3D/MINU2相关的SWI/SNF染色质重塑复合物及CAMTA1介导的信号通路协同参与开花时间的微调。此外，bZIP68调控网络与WRKY75、CAMTAs、EDM2-ASI1、ERF115和HY5等因子关联，提示其可能参与防御响应调控。
研究结论：本研究建立了一个整合性生物信息学分析流程，用于预测基因的潜在生理功能和调控网络。通过该方法预测bZIP68参与开花调控、非生物胁迫响应和防御相关应答，并通过5个独立突变体株系的表型分析提供了bZIP68参与开花调控的实验证据，为深入解析bZIP68的分子调控机制奠定了基础。该研究发表于《Biology》。
