Vip3Aa蛋白C端结构域氨基酸替换增强杀虫毒性

《Biology》：Amino Acid Substitutions in the C-Terminal Domains of Vip3Aa Enhance Insecticidal Toxicity

　　

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)分泌的Vip3蛋白因具有特异性且与Cry蛋白交叉抗性低，在生物防治中具有重要价值。揭示并通过增效手段提升此类蛋白的杀虫活性具有重要意义。本研究旨在考察Vip3Aa90蛋白结构域IV与V域V中特定氨基酸替换对其针对三种鳞翅目害虫杀虫活性的影响。研究人员通过定点诱变在大肠杆菌(Escherichia coli)中构建了双突变体S543N/I544L、三突变体S543N/I544L/E627A与S543N/I544L/S686R以及四突变体S543N/I544L/E627A/S686R；其中仅三突变体与四突变体可获得表达、纯化并用于生物测定。活性测定显示，两突变体对海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)在LC90水平毒性高于野生型(wild-type, WT) Vip3Aa90，四突变体在LC50水平略有提升；对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)与梨小食心虫(Grapholita molesta)未见增效，且四突变体对G. molesta毒性下降超10倍。结果表明，Vip3Aa C端氨基酸替换效应具有物种特异性，某些组合可显著提升对部分鳞翅目昆虫的毒性。

研究背景与立项依据

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是广泛使用的微生物杀虫剂来源，其产生的晶体蛋白(Cry)与溶胞蛋白(Cyt)机制明确，但部分害虫对Cry蛋白敏感性低且抗性问题突出。营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal proteins, Vip)，尤其是Vip3家族，因作用于中肠膜不同结合位点、与Cry无交叉抗性，被视为第二代杀虫蛋白与抗性治理关键组分。Vip3A由约790个氨基酸组成，含保守N端与可变C端，低温电镜解析显示其含五个结构域：N端结构域I–II维持四聚体稳定，C端结构域III–V参与受体结合，其中结构域IV与V被预测为糖结合模块(carbohydrate-binding modules, CBMs)，结构域V还参与围食膜(peritrophic matrix)结合。已有研究提示C端单点乃至多点替换可改变对靶标昆虫的毒性，但组合替换在Vip3Aa90中对不同鳞翅目害虫（尤其海灰翅夜蛾、甜菜夜蛾、梨小食心虫）的效应尚缺乏系统评价。鉴于此前Yang等报道三突变体S543N/I544L/E627A与S543N/I544L/S686R对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)增效显著，本研究在Vip3Aa90背景下重构上述组合并首次引入四突变体S543N/I544L/E627A/S686R，检验其跨物种毒性变化，以支撑下一代Vip3变体理性设计。论文发表于《Biology》。

主要技术方法概述

研究人员以携带vip3Aa90基因（NCBI XFO99222）的pet14b质粒为起点，采用QuickChange定点诱变依次构建双突变、三突变与四突变体，经测序确认后转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达，利用HisTrap FF亲和层析纯化原毒素(protoxin)，SDS-PAGE与密度测定定量。生物测定采用表面污染法，以人工饲料涂布纯化原毒素，对海灰翅夜蛾、甜菜夜蛾及梨小食心虫初孵幼虫进行剂量—反应 assay，25℃、16:8光周期下7天评估功能死亡率（死虫或停滞L1），Polo-PC计算LC₅₀与LC₉₀及置信限。样本为实验室饲养的三物种初孵幼虫队列。

研究结果

3.1 Vip3Aa90及突变体表达与纯化

诱导表达后，野生型、三突变体S543N/I544L/E627A与四突变体S543N/I544L/E627A/S686R可获得可溶性表达并经亲和层析纯化至电泳纯；双突变S543N/I544L与三突变S543N/I544L/S686R在本实验诱导条件下未获表达，尽管质粒构建成功。研究人员指出这可能与蛋白折叠、稳定性或表达效率有关，致使后续活性比较限于可表达的两株突变体。

3.2 Vip3Aa90及突变体杀虫活性

对S. littoralis，三突变体LC₉₀较野生型降低11.6倍，四突变体降低15.6倍，均显著增效；LC₅₀仅四突变体略优。对S. exigua，两突变体在LC₅₀与LC₉₀均与野生型无显著差异。对G. molesta，三突变体与野生型相当，四突变体毒性反而下降超10倍。结论：结构域IV（S543、I544、E627）与结构域V（S686）组合替换的效应高度依赖物种，非普适增效。

讨论部分总结

研究人员在讨论中指出，Vip3在抗性治理中价值在于提供非Cry途径杀伤；已有Vip3C、Vip3Af点突变体在田间或跨物种表现增效，印证多点替换策略可行。本研究所用位点在结构图上分属结构域IV（537–667）与结构域V（679–789）。Yang等曾在Vip3Aa背景下证三突变对S. frugiperda与H. armigera增效，本研究将同一组合扩展至Vip3Aa90并加入四突变，发现对S. littoralis增效但对S. exigua中性、对G. molesta有害，说明跨物种受体或中肠加工差异主导响应。未能表达的双突变与S686R三突变限制了单点贡献解析。四突变未优于三突变，提示S686R引入可能引构象扰动或影响碱性中肠蛋白酶切激活，需结构生物学验证。整体表明C端替换须按靶标物种分别评估。

结论翻译

本研究在Vip3Aa90结构域IV与V中构建多点突变，揭示三突变S543N/I544L/E627A与四突变S543N/I544L/E627A/S686R对农业鳞翅目害虫的杀虫活性。结果显示上述改变效应具物种特异性：相较野生型，两突变体对海灰翅夜蛾毒性增强，但对甜菜夜蛾与梨小食心虫无显著提升。基于纯化原毒素的实验室生物测定表明，特定残基改变对毒性的影响因靶标昆虫而异。