肥胖与非肥胖患者胆汁微生物群谱分析：鸟枪法宏基因组学与16S rRNA扩增子测序的比较

《Agronomy》：Bile Microbiota Profiling in Obese and Non-Obese Patients: A Comparison of Shotgun Metagenomics and 16S rRNA Amplicon Sequencing

　　

摘要
宏基因组学的最新进展扩展了研究人员检测低丰度微生物群落的能力。虽然肠道仍然是最密集的微生物栖息地，但新出现的证据提出，微生物也可能栖息于曾被视为无菌的解剖部位，例如胆道系统。研究人员应用下一代DNA测序来表征患有症状性胆囊结石的肥胖和非肥胖患者的胆汁细菌群落。胆汁样本采集自64名接受择期胆囊切除术的患者（32名肥胖，32名非肥胖）。研究人员纳入了阴性对照（无菌试管）和阳性对照（模拟微生物群落标准品）以评估污染风险。研究人员同时应用了16S rRNA基因扩增子测序和鸟枪法宏基因组测序。两种测序方法均检测到胆汁中极低的细菌生物量。具体而言，鸟枪法宏基因组测序仅在8个样本中鉴定出细菌DNA痕迹，且显示出极低的群落相似性。在阳性对照中，研究人员的测量确认了预期的微生物群落组成，而在阴性对照中未检测到细菌DNA。相比之下，16S rRNA基因测序在所有胆汁样本以及阴性对照中均检测到细菌DNA，表明其更容易受到污染。研究人员的发现表明，在无并发症的胆囊结石疾病中，胆汁可能并非始终被细菌群落所定植。

论文解读：基于双组学测序的肥胖与非肥胖患者胆汁微生物群再评估

研究背景与问题

人体 microbiome（微生物组）在健康与疾病中的作用近年来受到广泛关注。宏基因组学技术的进步使得研究人员能够绕过传统微生物培养的局限性，从而在低生物量样本中鉴定更广泛的微生物种类。传统观点认为，胆道系统在生理条件下是无菌环境，其防御机制包括胆汁流动、胆汁盐毒性以及黏膜免疫。然而，下一代测序技术的应用不断挑战这一传统认知，多项研究报道在胆道和胆囊中检测到微生物群落，并提出“胆汁微生物组”的概念。尽管如此，人类胆道环境是否确实维持着稳定的微生物群落，在学术界仍存在持续争议。争议的主要来源在于方法学上的诸多混杂因素，包括样本采集途径及括约肌切开术后污染、抗生素预防使用、低微生物生物量以及异质的生物信息学分析流程等。此外，肥胖是胆固醇性胆囊结石疾病最强的可改变风险因素之一，并会深刻改变肠道微生物组成和胆汁酸代谢。然而，肥胖对胆道微生物群可能产生的影响尚未得到充分探索。

研究目标

本研究旨在利用鸟枪法宏基因组测序和16S rRNA基因扩增子测序两种技术，对64例患有症状性无并发症胆囊结石的肥胖和非肥胖患者的胆汁样本进行表征，以评估胆汁中是否存在稳定的细菌群落。为最大限度减少污染风险，胆汁样本均在手术中从完整胆囊内无菌采集，避免了内镜下逆行胰胆管造影（ERCP）相关的污染，并在全流程中设置了严格的阴性和阳性对照。

主要技术方法

研究人员从2021年1月至2022年6月在意大利罗马S. Andrea大学医院和ICOT Hospital Latina接受胆囊切除术的患者中采集胆汁样本，共64例，分为肥胖组（BMI 30-50，32例）和非肥胖组（32例）。对于16S rRNA基因扩增子测序，研究人员从20份胆汁样本（肥胖和非肥胖各10例）中提取总DNA，扩增V3-V4区并在NovaSeq 6000平台测序，使用Kraken2配合SILVA数据库进行物种注释。对于鸟枪法宏基因组测序，研究人员对全部64份胆汁DNA样本在Illumina平台进行双端150 bp测序，测序深度不低于每样本10M reads，使用MetaPhlAn 4.0.6进行物种组成分析。研究还纳入了三个阴性对照（无菌试管）和两个阳性对照（含有8种细菌和2种酵母的商业模拟微生物群落标准品ZymoBIOMICS?），这些对照与胆汁样本并行处理。生物信息学分析包括使用FastQC进行质控，通过Kneaddata去除人类DNA污染序列，并使用phyloseq和vegan R包计算Chao1和Shannon多样性指数，进行主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS），以及通过线性判别分析效应大小（LEfSe）识别差异丰度物种。

研究结果

3.1 研究对象临床特征

研究共纳入64名患者，其中32名肥胖患者（BMI > 30）和32名非肥胖患者（BMI < 30），均患有症状性无并发症胆囊结石（无胆囊炎或胆管炎），并在资深外科医生操作下接受择期腹腔镜胆囊切除术。两组患者在年龄、性别和合并症方面具有同质性，术后无死亡或并发症报告。

3.2 16S rRNA基因扩增子测序的微生物组组成分析

16S rRNA扩增子测序显示胆汁样本中细菌相对丰度波动范围较大，细菌reads百分比介于2.5%至86.1%之间，人类reads介于0.04%至64.7%之间。阳性对照中细菌reads占中位数的94.6%，人类DNA低于总reads的0.05%。输入DNA浓度与扩增产物中人类DNA比例之间未观察到直接相关性。出乎意料的是，阴性对照中也检测到细菌DNA，其reads匹配SILVA 16S数据库的比例中位数为84.6%。在胆汁样本中共鉴定出262个属（丰度>0.1%），其中最主要的属为Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia（11.3%）、Candidatus Symbiobacter（8.3%）和Escherichia-Shigella（7.2%）。值得注意的是，胆汁样本中最主要的两个属与阴性对照中检测到的属完全相同。LEfSe分析（LDA分数阈值2，p<0.05）未在肥胖和非肥胖组之间鉴定出任何差异丰度的分类群。Chao1和Shannon指数分析未显示阴性对照、肥胖和非肥胖患者组之间存在显著的alpha多样性差异。NMDS分析未能在三组之间实现有效区分，热图分析也未观察到三组样本依据相似微生物模式形成的聚类。

3.3 鸟枪法测序不支持核心胆汁微生物群的存在

对64份胆汁DNA样本进行鸟枪法宏基因组测序，平均获得每样本1260万条双端reads。人类DNA污染占测序总reads的85.12%，仅有0.7%的reads可用于比对至细菌数据库。在64份样本中，仅8份（样本11、15、24、26、28、38、55和62）检测到比对至细菌数据库的reads。这些样本之间的细菌群落相似性极低，其中5份样本超过96%的reads来自单一物种，且每个样本的优势物种各不相同，分别是Enterobacter hormaechei、Escherichia coli、Lacticaseibacillus、Bifidobacterium animalis和Enterococcus faecium。其余3份样本分别鉴定出3、6和12个物种，重叠有限。其余56份患者样本未检测到细菌DNA。三个阴性对照中未检测到细菌DNA，仅有单个read对匹配到Cutibacterium，被认为是来自实验室试剂或操作的环境污染物。阳性对照中确认了预期的微生物群落组成（8种细菌和2种酵母），未检测到外源物种，验证了DNA分离工作流程的准确性。

讨论与结论

综合两种测序方法的结果，16S rRNA基因扩增子测序在胆汁样本和阴性对照中均检测到细菌DNA，且主要分类群与阴性对照一致，而鸟枪法宏基因组测序在绝大多数样本中未检测到细菌DNA。这种差异表明，16S rRNA基因扩增子测序在低生物量样本中检测到的信号很可能代表假阳性结果，其原因在于低生物量样本中的背景DNA在PCR扩增过程中可能竞争过样本自身极低拷贝数的DNA，导致扩增偏差。而鸟枪法宏基因组测序不涉及靶向PCR扩增步骤，因此不受此类偏差影响。本研究为第一个严格排除胆囊炎等胆道感染状态、在同一组胆汁样本上同时应用两种测序技术并纳入严格对照的研究。既往大多数研究通过ERCP途径采集胆汁，而该操作近期被证实存在将口腔和肠道微生物易位至胆道系统的高风险。研究人员的结论是，在无并发症胆囊结石疾病中，胆汁可能并非始终被细菌群落所定植，这一发现对既往基于16S rRNA扩增子测序提出的“胆汁微生物组”概念提出了挑战。同时需要区分“无菌”和“无DNA”两个概念，因为灭菌过程可消除活微生物但不一定去除所有微生物遗传物质，这一区别对微生物学研究和临床实践具有重要影响。