《Vaccines》：A Chimeric Virus Approach Reveals the Matrix (M) Gene as a Critical Modulator of Mumps Virus Neurovirulence
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背景/目的：自20世纪60年代引入减毒腮腺炎病毒（MuV）疫苗株以来，疾病发病率已显著降低；然而，近期疫情的再次暴发引发了对开发新疫苗的呼吁，以克服与免疫力衰退及出现与疫苗株抗原性不匹配的病毒株相关的疫苗效力下降问题。开发新型减毒活腮腺炎疫苗的一个主要障碍是确
背景/目的：自20世纪60年代引入减毒腮腺炎病毒（MuV）疫苗株以来，疾病发病率已显著降低；然而，近期疫情的再次暴发引发了对开发新疫苗的呼吁，以克服与免疫力衰退及出现与疫苗株抗原性不匹配的病毒株相关的疫苗效力下降问题。开发新型减毒活腮腺炎疫苗的一个主要障碍是确保其安全性，尤其是考虑到该病毒的嗜神经特性。事实上，在美国境外获准使用的几种疫苗株已被证明减毒不充分（如Urabe AM9疫苗株），并导致接种者发生无菌性脑膜炎，尽管在获批前已努力对这些菌株进行神经毒性检测。历史上，减毒是通过经验方法实现的，而神经毒力安全性的临床前检测已被证明不可靠。尽管近年来已做出努力，但腮腺炎病毒疫苗减毒的遗传基础仍未得到充分阐明。本研究的目的在于阐明Urabe AM9疫苗株神经毒力的遗传基础。方法：为此，研究人员生成了一系列嵌合病毒，将高度减毒的Jeryl Lynn（JL）疫苗株的基因与Urabe AM9疫苗株的相应基因进行交换。将所得的嵌合病毒在大鼠模型中测试其神经毒力，并表征其在体外和体内的复制能力。采用多层次方法，对每个cDNA构建体独立拯救并分析两到三个病毒，以减轻已识别的单核苷酸异质性的潜在脱靶效应。结果：所有病毒均显示在Vero细胞中具有复制能力，但在体内模型中观察到复制效率和病毒诱导的神经毒性的差异。在大鼠神经元细胞系中，Urabe AM9的M和HN基因对嵌合JL和Urabe AM9为基础病毒的生长具有相反的作用。结论：本文报告的结果表明，腮腺炎病毒的神经减毒是由多个基因的协同作用介导的，其中基质（M）基因发挥主导作用。这些发现为不断积累的证据增添了新的内容，为下一代减毒活腮腺炎病毒疫苗的合理设计提供了信息。
**研究背景、问题与意义**
腮腺炎病毒（MuV）感染可导致包括脑膜炎和脑炎在内的多种疾病表现，反映了该病毒的嗜神经特性。自20世纪60年代末广泛实施减毒活腮腺炎疫苗以来，疾病发病率显著下降，到21世纪初，腮腺炎在美国几乎被消除。然而，自2005年开始出现显著疫情复燃，其特征是在高接触环境（如大学校园和大型社交聚会）中接种疫苗的年轻人中暴发疫情。这些疫情被推测是由于疫苗诱导的免疫力减弱和/或疫苗株（主要为A基因型）与流行野毒株（主要为G基因型）之间的抗原不匹配所致。这促使人们重新关注开发更具免疫原性和“更新”的腮腺炎疫苗。
所有目前获准使用的MuV疫苗均为减毒活病毒，其神经减毒对安全性至关重要。然而，MuV神经减毒的分子决定因素仍不清楚。MuV是副黏病毒科（paramyxoviridae）、腮腺炎病毒属（Rubulavirus）的成员。病毒是有包膜的，含有一个负极性、不分节段的单链RNA基因组，大小为15,384个核苷酸。基因组包含七个基因，可表达九种蛋白质：核蛋白（N）由N基因编码，而非结构蛋白V（作为干扰素拮抗剂）由P/V/I基因编码，此外还编码磷蛋白（P）和推定非结构蛋白I。通过涉及RNA编辑和共转录添加两个或四个非模板G核苷酸的过程，产生P和I蛋白的转录本。基质（M）、融合（F）、小疏水（SH）和血凝素/神经氨酸酶（HN）蛋白分别由M、F、SH和HN基因编码。基质蛋白作为连接病毒核心与包膜蛋白的桥梁，在病毒组装、成熟和出芽中发挥作用。HN和F蛋白锚定在包膜内，促进与靶细胞膜的吸附和融合。SH蛋白被认为位于包膜内，具有抗凋亡特性，但并非体外或体内病毒复制所必需。RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）由大（L）蛋白与P蛋白共同形成。
由于MuV的嗜神经性，包括FDA在内的国家监管机构要求在动物模型中对候选疫苗进行神经减毒的临床前测试；然而，由于腮腺炎病毒神经毒性减毒的遗传基础尚未确定，这一直是一个经验性过程。这一点，加上用于MuV神经安全测试的动物模型并不总能预测人类反应的事实，导致了临床上使用了一些减毒不充分的疫苗，包括广泛使用的Urabe AM9疫苗，该疫苗曾导致接种者发生无菌性脑膜炎，随后被撤回。为支持安全腮腺炎疫苗的开发，研究人员建立了一种更可靠的临床前评估模型，并在理解MuV神经减毒方面取得了进展。值得注意的是，研究表明灭活MuV V基因可使神经毒力野生型分离株获得神经减毒。然而，神经减毒的Jeryl Lynn（JL）疫苗中的V基因并未被灭活，且研究人员先前证明将神经毒力分离株88-1961的V基因与JL的V基因交换并不能赋予神经减毒。同样，Lemon等人发现腮腺炎病毒F基因在适应仓鼠脑生长的MuV分离株的神经毒力中起作用；然而，将神经毒力分离株88-1961的F基因与JL的F基因交换并不能赋予神经减毒，而将JL的F基因与神经毒力分离株88-1961的F基因交换也不能赋予神经毒力。事实上，后一项工作表明神经毒力可能是一个涉及多个病毒基因的多基因性状。本研究使用减毒不充分的Urabe AM9（Ur）疫苗株进一步研究该问题。
**主要技术方法**
研究人员构建了一系列基于JL疫苗株cDNA克隆（pJL）的嵌合病毒cDNA，将Urabe AM9疫苗株（pUr）的M、F、SH、HN基因单独或组合替换为JL的相应基因，反之亦然。重组病毒在BHK-BSR-T7/5细胞中通过T7 RNA聚合酶系统拯救，并在Vero细胞中扩增。采用新生大鼠脑内接种模型评估病毒神经毒力（NV）评分（基于脑积水严重程度），并在Vero细胞、AF5大鼠神经元细胞系及新生大鼠脑中测定多周期生长动力学。通过高通量测序（HTS）和Sanger测序鉴定病毒准种中的单核苷酸异质性（SNH），每个cDNA构建体独立拯救2-3个病毒以减轻脱靶效应。
**研究结果**
**3.1 Urabe AM9 M、F、SH和HN基因与JL相应基因的联合替换赋予嵌合Urabe AM9病毒减毒特性**
在大鼠神经毒力试验中，rUr的平均NV评分为10.84，而rJL仅为0.81。单独将Urabe AM9的F、SH和HN基因替换为JL的相应基因仅导致NV评分略有降低，但无统计学显著性。相反，将Urabe AM9的M基因替换为JL的M基因（rUr + JL(M)）使神经毒力平均显著降低70%（范围45-85%）。通过构建仅替换M基因开放阅读框（ORF）而不替换侧翼调控序列的病毒（rUr + JL(M-ORF)），证实减毒效应源于M蛋白的质变而非调控序列差异。将F和HN基因联合替换（rUr + JL(F/HN)）使神经毒力平均降低23%，而替换F/SH/HN三个基因达到72%的平均降幅。当JL的M基因与F/SH/HN基因联合替换时（rUr + JL(M/F/SH)和rUr + JL(M/F/SH/HN)），NV评分分别降至1.74和2.06，接近rJL的0.81水平。
**3.2 Urabe AM9的M、F、SH和HN基因共同赋予嵌合JL病毒神经毒力**
将JL的M、F、SH和HN基因全部替换为Urabe AM9的对应基因后，所得嵌合病毒rJL + Ur(M/F/SH/HN)的神经毒力与亲本rUr病毒在统计学上无法区分（p = 0.5044）。单独替换各基因总体上使NV评分高于rJL，但差异较小且可能不具有生物学意义。当JL的F和HN基因被Urabe AM9的对应基因联合替换时（rJL + Ur(F/HNT577A)），平均NV评分约为rJL的四倍，但仍不足以使JL病毒达到Urabe AM9或rJL + Ur(M/F/SH/HN)的神经毒力水平。结果表明，Urabe AM9的M、F、SH和HN基因（尤其是M基因）共同存在是赋予JL骨干病毒野生型神经毒力表型所必需的，神经毒力和神经减毒均为多基因性状。
**3.3 重组病毒中脱靶核苷酸异质性的鉴定**
对41株重组病毒进行测序分析，其中34株存在至少10%频率的SNH，10株具有一个或多个≥50%频率的变异。多数高频变异为L基因中的单核苷酸替换。另外，在13株病毒的F基因末端信号中发现额外的U残基延伸，但仅在少数病毒中占优势。这些发现与先前观察一致，即重组MuV的拯救和传代可导致F基因末端信号同聚U串延伸，且已发表数据显示该延伸不影响MuV神经毒力。在病毒rUr + JL(F/SH/HN)-2中，HN基因末端信号存在额外U插入（占12%）；rUr + JL(F/HN)-3中59%的基因组在M基因末端信号存在额外U延伸。尽管无法排除SNH对神经毒力的影响，但多数SNH中突变变异体的丰度低于真实核苷酸，且少数高频突变为激进氨基酸改变。二至三重的病毒拯救和分析策略减轻了脱靶效应。
**3.4 重组病毒在Vero细胞中的有效生长评估**
Vero细胞生长动力学显示，绝大多数重组病毒在感染后2-3天达到峰值滴度，多数峰值滴度在6.1-7.2 log
10 pfu/mL范围内。然而，从pJL + Ur(HN)拯救的两株病毒仅生长至5.15和4.74 log
10 pfu/mL，这些病毒感染Vero细胞后快速形成大合胞体并在第3天完全裂解细胞，表明JL F与Urabe HN蛋白之间存在功能性不相容。相比之下，将Urabe HN基因替换为JL HN基因（rUr + JL(HN)）赋予Vero细胞复制优势，三株病毒的峰值滴度均超过rUr病毒。
**3.5 新生大鼠脑中的生长效率与大鼠NV评分相关**
对选定病毒进行新生大鼠脑内生长动力学分析显示，Urabe P-AM9病毒和两株rUr病毒达到最高脑内病毒滴度，而rJL-2生长至最低滴度。rUr + JL(M)、rUr + JL(M/F/SH/HN)和Urabe P6-CEF的滴度略高于rJL-2但低于Urabe病毒。将峰值脑内滴度与NV评分作图证实两参数之间存在良好相关性（r = 0.91）。
**3.6 大鼠神经毒力数据与体外峰值滴度的相关性**
Vero细胞中所有40株病毒的NV评分与峰值滴度之间仅呈中等相关性（r = 0.45），在检测脑内生长的七株病毒中也观察到类似相关性（r = 0.5），表明Vero细胞不能用于预测病毒神经毒力。在大鼠神经元AF5细胞中，rJL病毒复制极差（峰值116 pfu/mL），而rUr病毒约高一个log
10。含JL M基因或M-ORF的嵌合Urabe病毒（rUr + JL(M)、rUr + JL(M-ORF)）均生长至与rJL相当的低水平；相反，将JL M基因替换为Urabe M基因（rJL + Ur(M)）显著提高了AF5细胞中的病毒滴度，甚至超过rUr。HN基因替换实验显示，Urabe HN基因对JL和Urabe骨干病毒在AF5细胞中的生长均有负面影响（rJL + Ur(HN)无法产生感染性病毒），而JL HN基因则促进更有效的病毒释放。AF5细胞中的相关性（r = 0.47）与Vero细胞相似。
**讨论与结论**
讨论部分指出，腮腺炎疫情复燃部分归因于疫苗株与流行野毒株之间的遗传差异，促使开发新型疫苗。安全性问题仍是核心，JL株是目前全球使用最广泛且与无菌性脑膜炎无关联的疫苗株。开发新疫苗的策略包括替换JL株的F和HN蛋白，或对代表当前流行株的野生型分离株进行基因修饰。先前研究和对本研究均表明，单个基因替换通常不足以完全赋予或消除神经毒力，而M基因在神经毒力中发挥主导作用。JL M基因在Urabe骨干中的减毒效应比Urabe M基因在JL骨干中的神经毒力效应更显著，表明神经毒力和神经减毒涉及不同的遗传机制。M蛋白的五个氨基酸差异，特别是位于保守FPVI晚期结构域附近的M28V变化，可能影响与宿主ESCRT机制及细胞因子的相互作用。虽然关于V基因灭活和SH基因缺失的先前研究也显示了减毒效应，但本研究通过基因替换而非灭活手段，证实JL的N、P、L基因与Urabe的相应基因互换无显著生物学效应。研究还强调了大鼠NV试验的高变异性、伦理问题以及体外替代模型的局限性，并指出Vero细胞和AF5细胞与NV评分的相关性欠佳。第二点突变的高频发生凸显了对每个重组病毒进行测序和测试多个独立拯救病毒的必要性。最后，未来疫苗开发应将M和V基因的操纵视为确保减毒的关键。
研究结论部分：本研究表明，MuV M基因在决定神经毒力表型中起主导作用。将Urabe AM9的M基因替换为高度减毒的JL株的M基因，导致神经毒力显著降低70%，这是所观察到的最大单基因效应。将Urabe的M、F、SH和HN基因与其JL对应物联合替换几乎完全减毒了神经毒力的Urabe AM9病毒，而反向交换则将完全的神经毒力赋予JL，表明这四个基因对于决定神经毒力表型是必要且充分的。研究结果揭示，神经毒力是一个多基因性状，其中M基因发挥主导作用，而F和HN基因具有累加贡献。值得注意的是，JL M基因在Urabe背景上的减毒效应比Urabe M基因在JL背景上的效应更显著，提示神经毒力和神经减毒涉及不同的遗传机制。M蛋白的核心作用可能反映其在病毒组装和出芽中的基本功能；JL与Urabe M蛋白之间的五个氨基酸差异，特别是与保守FPVI晚期结构域相邻的M28V变化，可能影响与宿主ESCRT机制及其他对嗜神经性至关重要的细胞因子的相互作用。此外，JL M与其Urabe AM9来源的结合伙伴（如核蛋白和糖蛋白）的有效结合可能受到影响，值得进一步研究。本研究还为未来的疫苗开发研究提供了重要方法学见解。在大多数独立拯救的重组病毒中鉴定出单核苷酸异质性（SNH），强调了对每个病毒克隆进行测序、测试多个独立拯救病毒以及实施多层次验证方法的关键重要性。在拯救和传代过程中出现的高频第二点突变凸显了重组病毒系统的固有限制以及在病毒遗传学比较研究中严格质量控制的重要性。对于下一代腮腺炎疫苗的合理设计，这些发现表明，任何减毒野生型菌株的策略都应包括将M基因替换为JL的M基因，此外还需靶向其他基因，如V基因。将M基因鉴定为神经毒力的关键调节因子，为开发具有更高安全性的减毒活腮腺炎疫苗提供了基于证据的指导，这在当前接种人群中腮腺炎复燃以及对具有改善免疫原性和持久性的疫苗需求背景下尤为重要。
