《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Phage-first treatment results in subpopulation-driven collateral sensitivity to beta-lactams in an extensively drug-resistant Pseudomonas aeruginosa
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医院获得性铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染是最难治疗的感染之一，对多粘菌素和基于氨曲南的疗法等最后防线药物耐药，可能导致未来治疗选择有限或无药可用。噬菌体已成为有前景的治疗选择，无论是联合鸡尾酒疗法还是与抗生素联合使用。在本研究
医院获得性铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染是最难治疗的感染之一，对多粘菌素和基于氨曲南的疗法等最后防线药物耐药，可能导致未来治疗选择有限或无药可用。噬菌体已成为有前景的治疗选择，无论是联合鸡尾酒疗法还是与抗生素联合使用。在本研究中，研究人员证明，脂多糖（LPS）特异性噬菌体与抗生素之间的协同作用，是由噬菌体抗性亚群被选择后引起的β-内酰胺通透性临床相关增加所驱动。首先，在中空纤维感染模型（HFIM）中，研究人员发现噬菌体LUZ19（靶向菌毛）、噬菌体E215（LPS特异性）与氨曲南（ATM）联用可根除实验室宿主PAO1，而单独使用噬菌体或ATM均不能根除PAO1。静态时间-杀菌研究（STKS）评估了LPS特异性噬菌体PYO2与氨曲南/阿维巴坦（ATM/AVI）或多粘菌素B（PMB）联用对一株广泛耐药铜绿假单胞菌临床分离株（AR-0231）的活性。PYO2联合ATM/AVI被判定具有协同作用，平均超额Bliss值（EOB）为0.350（P < 0.05）；PYO2联合PMB也呈协同作用，平均EOB为0.361（P < 0.05）。采用序贯给药的STKS线性回归分析显示，与抗生素优先治疗相比，噬菌体优先治疗在24小时将细菌浓度降低?6.19 log10菌落形成单位（CFU）/mL（P < 0.05），每种抗生素均估计存在统计学显著交互作用。这些结果表明，PYO2对细菌的预选择提高了抗生素活性。质谱研究显示，PYO2抗性AR-0231菌株对所有主要抗假单胞菌β-内酰胺类（包括氨曲南）的外膜通透性表面积系数均增加超过25%。总之，该研究为噬菌体诱导的β-内酰胺附带敏感性提供了机制性见解，并展示了如何在噬菌体-抗生素联合方案中优先选择和优化特定β-内酰胺类药物，以最大化抗菌活性。
抗生素耐药是导致全球治疗失败和感染复发的主要原因。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为ESKAPE病原体之一，可引起肺炎、手术部位感染、泌尿道感染、烧伤创面感染及血流感染等严重院内感染。美国疾病控制与预防中心的数据显示，2019年多重耐药铜绿假单胞菌在美国住院患者中造成了约32,600例感染和2,700例死亡，可选药物日益减少。抗假单胞菌β-内酰胺类药物（如碳青霉烯类、氨曲南、头孢他啶、头孢吡肟和哌拉西林）是治疗铜绿假单胞菌感染最重要的药物之一，其中氨曲南是唯一对金属-β-内酰胺酶（MBLs）稳定的β-内酰胺，与丝氨酸-β-内酰胺酶抑制剂阿维巴坦（AVI）联用时可保留对同时产两类酶菌株的活性。多粘菌素类抗生素（如多粘菌素B，PMB）也是重要的最后防线药物，但其通过靶向脂质A发挥去垢样作用；然而，对这些最后防线药物的耐药日益增加，迫使临床寻求噬菌体等替代策略。
噬菌体是感染并裂解细菌的病毒，具有安全性高、特异性强和快速杀菌的特点。铜绿假单胞菌噬菌体常以LPS、IV型菌毛和孔蛋白作为受体。LPS是常见噬菌体受体之一，也参与宿主免疫应答、组织损伤、抗生素耐药和生物膜形成。已知与多粘菌素耐药相关的LPS改变可增加膜通透性，这为噬菌体与抗生素联用提供了理论基础。该研究发表于《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》，旨在阐明LPS特异性噬菌体是否通过选择噬菌体抗性亚群，导致膜通透性改变，从而产生对β-内酰胺类药物依赖性附带敏感性。
研究人员首先在动态给药的中空纤维感染模型（HFIM）中，利用实验室铜绿假单胞菌PAO1验证了菌毛靶向噬菌体LUZ19与LPS特异性噬菌体E215联合氨曲南（ATM）的协同杀菌概念。随后，针对临床广泛耐药（XDR）分离株AR-0231（产KPC-5，对多种β-内酰胺耐药），采用静态时间-杀菌研究（STKS）评估LPS特异性噬菌体PYO2与ATM/AVI或PMB联用的效果，并通过序贯给药比较噬菌体优先与抗生素优先策略。为探究机制，研究人员利用基于LC-MS/MS的通透性测定方法，量化六种抗假单胞菌β-内酰胺类药物在野生型和PYO2抗性突变株中外膜通透性表面积系数的变化，并结合数学建模和全基因组测序分析耐药突变。研究样本包括实验室菌株PAO1和来自FDA/CDC AR Bank的临床分离株AR-0231。
主要结果如下：
**在HFIM中评估噬菌体-抗生素协同作用**
LUZ19或E215单用仅产生短暂杀菌作用，在8小时出现>3 log10 CFU/mL的下降后，24小时内反弹至系统承载量。LUZ19与E215联用时出现两次不同的杀菌波峰，分别对应两种噬菌体的增殖。低剂量ATM单药产生杀菌活性（下降3.40 log10 CFU/mL），但随后持续存在低水平菌量。LUZ19+E215+ATM三联方案在6小时内根除PAO1。扫描电镜显示ATM单药诱导明显的丝状化表型，而三联方案中仅观察到碎片。
**噬菌体-抗生素治疗对产KPC-5铜绿假单胞菌的活性**
在STKS中，PMB单药最强（5 mg/L时下降5.82 log10 CFU/mL），ATM/AVI最高浓度下降2.07 log10 CFU/mL，PYO2单药下降3.97 log10 CFU/mL。PYO2与ATM/AVI或PMB联用时，细菌最大降幅均超过单药。Bliss独立性分析显示ATM/AVI和PMB与PYO2联用均存在统计学显著协同（平均EOB分别为0.350和0.361，P < 0.05）。
**双向亚群选择对噬菌体-抗生素协同作用的影响**
序贯STKS中，所有抗生素在噬菌体优先给药（先加PYO2，8小时后加抗生素）时的24小时细菌浓度均显著低于抗生素优先给药。线性回归显示，噬菌体优先治疗使24小时细菌浓度下降?6.19 log10 CFU/mL（P < 0.05）。该结果表明，PYO2预先选择细菌亚群可提高β-内酰胺类药物的活性，且这种改善在β-内酰胺类中比PMB更明显。
**PYO2耐药对β-内酰胺通透性的影响**
LC-MS/MS检测及数学建模结果显示，PYO2抗性突变株（AR0231-PYO2R）对六种β-内酰胺类药物的外膜通透性表面积系数均较野生型增加超过25%，其中氨曲南的通透性增幅达1.97倍，亚胺培南为2.83倍，哌拉西林为1.87倍。模拟研究预测，在临床相关游离稳态浓度下，通透性增加可增强抗菌作用。这提示PYO2耐药导致的LPS改变是β-内酰胺附带敏感性的机制基础。
**PYO2耐药菌株对β-内酰胺单药敏感性的增加**
在30 mg/L浓度下进行的STKS验证实验中，与野生型AR-0231相比，AR0231-PYO2R对所有六种β-内酰胺类均表现出平均1.06 log10 CFU/mL的额外细菌降低。由于该菌株仍产KPC-5，并未达到完全敏感，但结果与通透性升高一致，支持耐药亚群对β-内酰胺敏感性增强的趋势。
**全基因组测序**
对AR0231-PYO2R进行全基因组测序，发现共10个SNP/插入缺失，其中两个突变位于LPS生物合成基因：O-抗原链长调节基因wzz发生单碱基缺失导致的移码突变，以及α-1,6-鼠李糖基转移酶基因migA的错义突变（Leu294Arg）。其余突变位于功能未知的假设蛋白基因或基因间区。wzz和migA的突变可能通过改变O-抗原和核心寡糖结构，增加外膜通透性。
讨论部分指出，ATM单药诱导的丝状化可能增加细菌生物量，为噬菌体复制提供更多资源，从而促进与含ATM方案的协同。本研究将附带敏感性定义为噬菌体施加选择性压力后，存活的噬菌体抗性亚群的基因型或表型改变导致其对另一抗菌药物（β-内酰胺类）敏感。噬菌体优先给药策略在临床上可能适用于某些慢性感染。LC-MS/MS结果证实所有六种β-内酰胺的通透性在PYO2耐药突变体中均显著增加。全基因组测序表明，PYO2耐药主要源于wzz移码突变和migA错义突变，这些LPS修饰可能同时增强多粘菌素类药物的靶点可及性。研究局限性包括HFIM中ATM剂量仅为标准日剂量的25%、实验系统缺乏宿主免疫反应等。总之，优化噬菌体-抗生素联合方案需要深入理解亚群动态和药效学相互作用，序贯给药策略可能最大化联合治疗获益。研究结论为：LPS特异性噬菌体诱导的噬菌体抗性亚群通过增加外膜通透性，产生了对β-内酰胺类药物的附带敏感性，这为在噬菌体-抗生素联合治疗中优先选择和优化特定β-内酰胺类药物提供了机制依据。
