《Analytical Biochemistry》：A CRISPR/Cas9 multiplex nucleic acid sensing platform based on rolling circle amplification-mediated monomeric substrate generation
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•提出了一种基于CRISPR/Cas9的传感平台，用于检测核酸生物标志物。•CRISPR/Cas9系统通过聚合酶链式扩增（RCA）生成的单体底物被激活。•实现了对多种ctDNA的灵敏和同时检测。•实现了对多种miRNA的灵敏和同时检测。•分析了临床血清样本。引言簇状规律间隔短回文
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提出了一种基于CRISPR/Cas9的传感平台，用于检测核酸生物标志物。
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CRISPR/Cas9系统通过聚合酶链式扩增（RCA）生成的单体底物被激活。
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实现了对多种ctDNA的灵敏和同时检测。
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实现了对多种miRNA的灵敏和同时检测。
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分析了临床血清样本。
引言
簇状规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白（CRISPR/Cas）系统是细菌和古菌在漫长进化过程中进化出的适应性免疫机制[1]、[2]。该系统使这些微生物能够保留对曾经感染它们的特定病毒片段或其他入侵核酸的分子记忆。当再次接触到这些遗传入侵者时，CRISPR/Cas系统能够迅速识别并降解外来核酸，从而保护宿主基因组的完整性[3]、[4]。从根本上说，CRISPR/Cas系统通过高度特异性地识别和结合目标DNA或RNA序列，然后在预定位置进行精确切割来发挥作用。利用这一固有的能力，特别是像CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9这样的变体，该系统已被创新性地用作一种多功能的基因编辑技术，促进了基因敲除、基因敲入和基因表达调控等应用[5]、[6]。由于其卓越的灵敏度、特异性、适应性和信号放大能力，CRISPR/Cas技术在生物传感和分子诊断领域显示出了巨大的潜力[4]、[7]、[8]、[9]。
在生物 sensing和分子诊断的背景下，激活CRISPR/Cas系统需要一个驱动机制。目前，常见的驱动机制是由特定目标刺激引发的底物生成反应。更准确地说，系统内特定目标的存在会诱导诸如链置换反应（SDR）[10]、[11]、催化发夹组装（CHA）[12]、[13]、杂交链反应（HCR）[14]、[15]或聚合酶链式扩增（RCA）[16]、[17]等反应。这些反应产生底物（定义的DNA或RNA序列），激活Cas蛋白的切割功能，从而实现传感和分子诊断应用。其中，SDR、CHA和HCR的优点在于它们的反应产物通常是单体底物或刚性双链结构，有利于Cas蛋白的有效识别和结合。然而，这些方法基于的发夹自组装机制对组装过程有动力学限制，导致扩增效率相对较低。相比之下，作为酶驱动的扩增策略，RCA实现了显著更高的效率。然而，RCA产生的长链、重复序列和单链产物倾向于形成空间缠结的聚集体，这引入了空间障碍，阻碍了Cas蛋白与目标底物之间的有效相互作用[18]。设计具有类似单体底物结构的RCA产物可能克服这一限制，从而提高结合效率并增强整体检测性能。此外，现有的利用CRISPR技术的生物传感和分子诊断平台主要关注于识别单一目标[4]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。同时检测多个目标的能力将在提高诊断准确性方面带来显著好处。
本研究介绍了一种基于CRISPR/Cas9的多重传感平台，该平台利用RCA介导的单体底物生成来检测核酸生物标志物。检测策略包括两个不同的连续切割步骤：首先，内切酶切割RCA产物以产生单体双链底物；随后，CRISPR/Cas9系统进一步处理这些底物以产生荧光信号。目标诱导的RCA反应有效地激活了CRISPR/Cas9系统，其中内切酶介导的切割减轻了由折叠RCA产物引起的空间障碍。这种机制通过荧光强度大约提高两倍得到了实验验证，显著增强了Cas蛋白的活性。为了实现多重检测，设计了三组特定的锁形探针、报告分子和单引导RNA（sgRNAs），以选择性目标三种不同的核酸序列。该平台展示了对多个核酸目标的极高灵敏度和同时检测能力，检测限达到了飞摩尔（fM）或更低水平。通过调整探针和引导序列，该平台适用于检测循环肿瘤DNA（ctDNA）和微小RNA（miRNA），突显了其在生物传感和分子诊断应用中的潜在效用。
章节片段
传感协议
首先，将冻干后的DNA和RNA粉末用TE缓冲液复溶，制备出所需浓度的稀释溶液。然后，将2.0 μL的锁形探针P1、P2和P3（每种浓度为200 nM）与2.0 μL的不同浓度的目标序列T1、T2和T3混合在Tris-HCl缓冲液中。向此混合物中加入2.0 μL的T4 DNA连接酶（5 U/μL）、1.0 μL的phi29 DNA聚合酶（10 U/μL）、5 μL的dNTP和1.0 μL的Nt.BsmAI（10 U/μL）
基于聚合酶链式扩增介导的底物生成的CRISPR/Cas9多重核酸传感平台的工作原理
基于聚合酶链式扩增（RCA）介导的底物生成的CRISPR/Cas9多重核酸传感平台的工作原理如图1所示。检测过程包括两个主要阶段：首先是通过RCA生成底物，其次是通过CRISPR/Cas9系统产生信号。以目标T1作为代表模型来阐明检测机制，一个锁形探针（P1）被战略性地
结论
总之，开发了一种基于RCA介导的单体底物生成的多重传感平台。与传统RCA长产物相比，单体底物模型展现了更强的传感能力和改进的分析性能。这种方法具有很强的通用性；通过修改相应的功能序列，它实现了对ctDNA和miRNA的灵敏、特异性和同时检测，达到了一定的LOD（检测限）
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（82403694）、山东省自然科学基金（ZR2024QH631）和山东省高等教育“青创”科技计划（2025KJJ053）的支持。
魏 利
