《Animal Feed Science and Technology》：Zinc oxide nanoparticles influence methane production and endoparasitic infection in lambs with minimal changes in key bacterial taxa
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摘要
氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs）是一种具有潜在驱虫效应并能够减少肠道甲烷（CH?）排放的可持续饲料添加剂。本研究评估了作为一种商业产品（SkySpring Nanomaterials, Inc., Houston, USA）的ZnO-NPs对感染胃肠道线
摘要
氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs）是一种具有潜在驱虫效应并能够减少肠道甲烷（CH?）排放的可持续饲料添加剂。本研究评估了作为一种商业产品（SkySpring Nanomaterials, Inc., Houston, USA）的ZnO-NPs对感染胃肠道线虫Haemonchus contortus的羔羊的干物质消化率（DMD）、体重、寄生虫学状态、瘤胃发酵、肠道二氧化碳（CO?）和CH?排放的影响。研究人员将24只羔羊分为四组（每组n = 6）：饲喂基础日粮的对照组（CON）、补充ZnO-NPs的对照组（CON-ZnO-NP）、感染且饲喂基础日粮组（INF）以及感染且补充ZnO-NPs组（INF-ZnO-NP）。感染组在第0天接受约5000只第三期幼虫，而ZnO-NP补充从第1天开始并持续39天。在最后九天使用开放式呼吸代谢舱测量肠道气体排放。与CON组相比，INF组的DMD降低了6%，而相对于INF组，补充ZnO-NPs使INF-ZnO-NP组的DMD提高了8%。感染组的瘤胃pH值和氨氮浓度显著高于未感染组。在最后一周，与INF组相比，INF-ZnO-NP组的粪便虫卵计数减少了39.9%–52.9%。补充ZnO-NPs使感染羔羊的CO?排放降低了12%，CH?排放降低了20%。总体而言，ZnO-NPs减少了寄生虫负荷和肠道气体排放，同时提高了消化率，证明了其在不同养殖条件下作为一种功能性饲料添加剂的潜力。
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**1. 研究背景与问题**
畜牧业是温室气体（GHG）的重要来源之一，其中反刍动物瘤胃发酵产生的甲烷（CH?）不仅加剧了全球气候变化，还导致了饲料能量的浪费，降低了饲料转化效率。与此同时，胃肠道线虫（GINs）感染是反刍动物生产中普遍存在的健康问题，它通过影响饲料摄入、养分利用和动物生产力等途径，可能进一步改变CH?的排放强度。传统上，GINs的控制主要依赖化学驱虫药的反复使用，但频繁和不合理用药已导致全球范围内广泛的抗药性问题，尤其是捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）已对多种常用驱虫药产生耐药性甚至多药耐药性。此外，现有CH?排放估算模型通常仅基于家畜数量和生产时间等基础乘数，并未考虑寄生虫感染状态的潜在影响，这可能导致对实际排放量的低估。
近年来，纳米医学领域的进展为抗寄生虫策略提供了新思路。氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs）因其具有抗菌、免疫调节和驱虫等生物学特性，已被探索作为动物饲料添加剂。ZnO-NPs能够干扰寄生虫细胞膜完整性并产生毒性H?O?，同时可能通过影响瘤胃发酵参数、氨氮浓度和养分消化率来调节瘤胃代谢。尽管已有研究关注ZnO-NPs对羔羊生长和寄生虫学状态的影响，但关于其同时调节CH?排放与寄生虫感染的协同机制研究仍十分有限。基于此，研究人员假设ZnO-NPs能够通过调节瘤胃微生物活性，在减少H. contortus感染负荷的同时降低CH?排放，并系统评估了其对羔羊瘤胃发酵、肠道气体排放及寄生虫学状态的影响。
**2. 主要研究内容与结论**
本研究旨在探究饲料添加剂ZnO-NPs对实验性感染H. contortus的羔羊瘤胃发酵、肠道CH?与CO?排放以及寄生虫学状态的影响。研究采用完全随机区组设计，将24只Wielkopolska品种雄性羔羊（5–6月龄，平均初始体重30.2 ± 2.39 kg）分为四组：CON组（基础日粮）、CON-ZnO-NP组（基础日粮补充ZnO-NPs，99 mg Zn/kg精料）、INF组（感染H. contortus，基础日粮）和INF-ZnO-NP组（感染并补充ZnO-NPs）。感染组于第0天经口感染约5000只H. contortus第三期幼虫（MHco1株），ZnO-NP补充从第1天持续至第39天。实验期间利用开放式呼吸代谢舱在最后九天测定气体交换，并定期采集粪便、瘤胃液和血液样本进行寄生虫学、发酵参数及微生物学分析。
研究得出以下主要结论：H. contortus感染显著降低了羔羊的干物质消化率（DMD），较对照组低6%；而ZnO-NP补充使感染羔羊的DMD较未补充的感染组提高了8%。感染还导致瘤胃pH值和氨氮（NH?-N）浓度显著升高。在寄生虫学方面，ZnO-NP补充使感染羔羊在实验最后一周的粪便虫卵计数（EPG）显著减少39.9%–52.9%，且从第33天起粪检虫卵减少率（%FECR）超过40%。在气体排放方面，ZnO-NP补充使感染羔羊的CO?排放降低12%，CH?排放降低20%，而感染本身使CH?排放较对照组增加了21%。主成分分析（PCA）显示，感染羔羊与较高的虫卵数、CH?和CO?排放及NH?-N浓度相关，而ZnO-NP补充组则与较高的DMD和生长性能指标相关联。值得注意的是，尽管ZnO-NP补充对上述功能参数产生了显著影响，但所检测的关键瘤胃细菌类群（如Fibrobacter succinogenes、Ruminococcus flavefaciens、Butyrivibrio proteoclasticus等）的相对丰度并未发生显著变化，表明ZnO-NPs的作用可能并非主要通过改变这些核心菌群来实现。
**3. 关键技术方法**
研究人员使用了以下主要技术方法以获取可靠数据：采用开放式呼吸代谢舱系统（SPA System Ltd., Wroc?aw, Poland）并结合非色散红外气体分析仪（SERVOMEX 4100）连续监测羔羊的CH?和CO?排放，动物采用两两配对方式进入代谢舱以兼顾福利与数据质量；采用改良McMaster计数法评估粪便虫卵数并计算%FECR；通过瘤胃瘘管定期采集瘤胃液，使用数字pH计测定pH值，采用Nessler比色法测定NH?-N浓度，利用气相色谱分析短链脂肪酸（SCFAs）谱，并在光学显微镜下进行原虫计数；提取瘤胃微生物DNA后，采用定量PCR（qPCR）技术对Ruminococcus flavefaciens、Fibrobacter succinogenes、Streptococcus bovis、Butyrivibrio proteoclasticus、Ruminococcus albus、Butyrivibrio fibrisolvens、Prevotella spp.及产甲烷菌等目标菌群进行绝对定量，结果以目标基因拷贝数/16S rRNA基因拷贝数表示；最后应用双因素和三因素混合模型方差分析及主成分分析（PCA）对多维数据进行统计处理。
**4. 研究结果分述**
**4.1 干物质消化率与生长参数**：研究发现，H. contortus感染显著降低了羔羊的DMD（INF组较CON组低6%，P = 0.005），而ZnO-NP补充使INF-ZnO-NP组的DMD较INF组提高了8%，表明ZnO-NPs能够部分缓解感染引起的消化功能损伤。尽管感染组的最终体重（INF为35.84 kg，INF-ZnO-NP为36.19 kg）低于对照组（CON为37.81 kg，CON-ZnO-NP为38.11 kg），但差异未达到统计学显著水平（P = 0.087）。
**4.2 寄生虫学状态**：两组感染羔羊从第18天开始排出虫卵。INF组的高虫卵排放持续至实验结束（第39天），而INF-ZnO-NP组从第33天起虫卵排放明显下降，至第39天达到最高%、FECR为52.9%（P = 0.019）。统计学分析显示饮食对EPG有显著影响（P = 0.004），表明ZnO-NP补充能够有效抑制H. contortus的繁殖。
**4.3 瘤胃发酵参数与微生物群**：感染显著影响了瘤胃pH值（P < 0.001）和NH?-N浓度（P = 0.010），感染组的pH值和NH?-N浓度均高于未感染组。时间、感染和饮食三因素对大多数SCFA参数存在显著的交互效应。在微生物群方面，Butyrivibrio proteoclasticus和Fibrobacter succinogenes的相对丰度受感染显著影响（P = 0.007和P = 0.040），但各组间总原虫、Holotricha和Entodiniomorpha数量无显著差异。总体上，ZnO-NP补充对所选关键细菌类群的相对丰度未造成明显改变，仅产甲烷菌数量随时间变化显著（P = 0.006）。
**4.4 CO?和CH?排放**：ZnO-NP补充使感染羔羊的CO?排放降低12%（P = 0.04）。感染显著提高了CH?排放，INF组较CON组高出21%；而ZnO-NP补充使INF-ZnO-NP组的CH?排放较INF组显著降低20%（P = 0.005），显示ZnO-NPs具有缓解肠道CH?排放的潜力。
**4.5 主成分分析**：PCA提取的前两个主成分（PC1和PC2）分别解释了总方差的59.97%和28.83%。PC1将感染羔羊（位于左侧，与高EPG、高CO?和CH?排放、高NH?-N、高丁酸比例及高A/P比相关）与未感染羔羊（位于右侧，与较高的日增重、最终体重、DMD和丙酸比例相关）清晰区分。PC2进一步将两个ZnO-NP补充组（具有负值PC2）与其他组分离。这一结果表明，ZnO-NP处理能够在一定程度上抵消感染对代谢和排放的不利影响。
**5. 讨论与结论**
讨论部分指出，H. contortus感染导致的DMD下降和CH?排放增加与多项前期研究结果一致，但不同研究间在排放增幅上存在差异，可能归因于寄生虫种类、感染强度和宿主品种等因素。ZnO-NPs的驱虫机制可能并非直接杀伤虫体，而是通过增强宿主免疫防御和改善营养利用效率来间接抑制虫卵排出，因为虫卵减少效应在感染后第30天才开始显现。此外，尽管ZnO-NP补充显著影响了发酵参数与气体排放，但所选瘤胃细菌类群并未发生显著变化，提示其作用机制可能涉及未被检测的微生物类群或直接的宿主代谢调节，而非简单的菌群丰度改变。研究还讨论了呼吸代谢舱配对测量的局限性，以及瘤胃瘘管动物数量较少对微生物数据统计效力的影响，建议在后续研究中采用更大的样本量和更全面的宏基因组学方法加以验证。
研究结论表明，ZnO-NP补充能够增强营养利用效率，部分缓解H. contortus感染对羔羊造成的不利影响，包括提高干物质消化率、降低粪便虫卵计数，以及减少肠道CO?排放和单位干物质采食量的CH?产量（以代谢舱内成对动物平均的单只动物当量表示）。这些发现表明，ZnO-NPs作为一种兼具抗寄生虫活性和减少甲烷排放功能的新型饲料添加剂具有广阔的应用前景。本研究结果支持在多样化养殖条件下将ZnO-NPs用作功能性饲料添加剂以改善动物健康并降低畜牧业环境足迹的可行性，但最佳添加剂量、长期应用效果及其在商业化生产中的适用性仍需进一步研究确证。
