甜瓜（*Cucumis melo* L.）CmABF基因家族的全基因组鉴定及其对臭氧和ABA的响应

《Horticulturae》：Genome-Wide Identification of the CmABF Gene Family in Melon (Cucumis melo L.) and Their Response to Ozone and ABA

　　

摘要

甜瓜（*Cucumis melo* L.）是一种具有全球重要意义的经济园艺作物，其果实品质和采后货架期深受氧化胁迫的影响。脱落酸（abscisic acid, ABA）响应元件结合因子（ABA-responsive element binding factors, ABFs）属于碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）转录因子家族的A亚族，是ABA信号通路中的关键组分。这些因子在调控植物非生物胁迫响应以及果实发育与成熟过程中发挥着重要作用。本研究利用全基因组鉴定技术，在甜瓜基因组中成功鉴定出9个CmABF基因家族成员（CmABF1–CmABF9）。生物信息学分析表明，所有CmABF蛋白均含有保守的bZIP结构域。理化性质分析显示，大多数此类蛋白为不稳定的亲水性蛋白，且全部定位于细胞核中。系统发育分析将CmABF家族划分为三个不同的进化分支（Group A、B和C），与拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）、马铃薯（*Solanum tuberosum*）等物种中的同源基因表现出高度保守性。启动子分析表明，CmABF基因富含激素响应元件（如ABA响应元件（ABRE）和赤霉素响应元件（GARE））以及胁迫响应元件（如MYB结合位点（MBS）和厌氧响应元件（ARE））。为研究其对氧化胁迫和ABA信号的响应，研究人员利用RNA-seq和qRT-PCR技术，分析了在臭氧（O₃，一种氧化胁迫因子）、外源ABA以及ABA合成抑制剂去甲二氢愈创木酸（nordihydroguaiaretic acid, NDGA）处理条件下，甜瓜果实在采后贮藏0、7、14、21、28和35天时的基因表达模式。结果表明，臭氧处理显著诱导了CmABF9的上调表达，同时抑制了CmABF2和CmABF4的早期表达。ABA处理在贮藏后期（35 d）普遍促进了家族成员的转录。NDGA处理在贮藏早期（7 d）抑制了CmABF2和CmABF4的表达，而在贮藏后期（28 d和35 d）显著提高了二者的表达水平，这表明在内源ABA缺乏条件下可能存在补偿性反馈响应。此外，蛋白质-蛋白质相互作用预测表明，CmABF蛋白与SnRK2蛋白激酶之间可能存在密切的相互作用。本研究为阐明CmABF家族在调控甜瓜采后氧化胁迫中的分子机制提供了理论依据，并为通过分子育种提高甜瓜果实抗逆性、延长货架期提供了候选基因资源。

**甜瓜CmABF基因家族的全基因组鉴定及其采后氧化胁迫与ABA信号响应研究解读**

**一、研究背景与科学问题**

甜瓜（*Cucumis melo* L.）隶属于葫芦科（Cucurbitaceae），因其独特的风味和丰富的营养价值而在全球广泛栽培和消费。然而，甜瓜果实在采收后仍保持活跃的代谢状态，在常温或低温贮藏过程中极易受到病原菌侵染和氧化胁迫的影响，导致果实软化、褐变和风味丧失，进而造成严重的采后经济损失。因此，解析植物响应氧化胁迫的转录调控网络，并据此开发有效的采后保鲜策略，已成为园艺生物技术领域的研究热点。

转录因子（transcription factor, TF）作为分子开关，通过特异性结合靶基因启动子区的顺式作用元件来调控转录活性，从而协调植物对环境挑战的防御反应。碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）家族是植物中最大且功能最多样化的TF家族之一，其成员通过高度保守的bZIP结构域特异性结合靶序列，调控包括生长发育、光响应和逆境防御在内的多个生物学过程。根据DNA结合偏好性和结构特征，bZIP家族可分为多个亚组，其中A亚组（Group A）主要包括脱落酸响应元件结合蛋白/因子（AREB/ABF），这些蛋白能够特异性识别启动子区域的ABA响应元件（ABRE; CACGTGGC），是脱落酸（abscisic acid, ABA）信号通路中的关键下游效应因子。

ABA作为一种重要的植物激素，在植物非生物胁迫响应中发挥核心调控作用，同时也是参与果实成熟、衰老及氧化胁迫反应的关键激素。已有研究表明，ABF/AREB转录因子能够通过其bZIP DNA结合结构域识别并结合靶基因启动子中的ABRE元件，从而促进多种抗氧化相关基因的转录，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）和过氧化物酶（peroxidase, POD）等，进而增强清除活性氧（reactive oxygen species, ROS）的能力，减轻氧化损伤。这些发现普遍支持ABFs在抗氧化防御相关基因表达中的正向调控作用。

臭氧（O₃）凭借其强杀菌能力和无残留特性，被广泛用作果蔬采后保鲜处理手段。除抗菌作用外，O₃还具有适度的氧化激发特性，可控的O₃暴露可诱导内源抗氧化防御系统并延缓果实衰老。然而，尽管甜瓜基因组序列已多次更新，但对甜瓜中ABF亚组成员的系统鉴定及其在采后氧化胁迫下的调控机制，特别是与臭氧处理等新型保鲜手段的相互作用，仍缺乏深入研究。100 μM ABA在采后生理中的调控作用已在草莓、甜樱桃和南果梨等多种果实中得到证实，但针对100 μM ABA在甜瓜果实中的类似研究仍然缺乏，且ABA信号与臭氧激发响应之间的潜在交互作用尚未得到探讨。为验证O₃的作用是否由ABA介导，研究人员使用了NDGA——一种ABA生物合成抑制剂，通过抑制ABA生物合成中的限速酶9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶来抑制内源ABA积累，从而剖析ABA依赖的信号通路。

**二、主要技术方法**

本研究以天津静海区采收的甜瓜品种‘西州蜜25号’为实验材料，共设置11个处理组，分别采用臭氧熏蒸（15 mg/m3，每周一次）、外源ABA和NDGA浸果处理，在1 ± 1 °C、相对湿度70–75%条件下贮藏35天。研究综合运用了以下关键方法：利用HMMER和BLAST进行全基因组范围的CmABF家族成员鉴定；使用生物信息学工具进行理化性质、亚细胞定位预测和AlphaFold 3三维结构预测；通过MEGA12邻接法构建多物种系统发育树；利用TBtools进行染色体定位、基因结构和共线性分析；通过MEME和Batch CD-Search进行保守基序和结构域分析；使用PLACE和PlantPAN预测启动子顺式作用元件；利用STRING预测蛋白质相互作用网络。在基因表达分析方面，选取0 d和21 d的样品进行RNA-seq测序，并对0、7、14、21、28、35 d六个时间点的样品进行qRT-PCR验证。

**三、研究结果**

**3.1 CmABF家族的鉴定、理化性质及三维结构分析**

通过HMMER和BLAST结果取交集，共鉴定出9个CmABFs（CmABF1–CmABF9）。编码蛋白长度介于211至525个氨基酸之间。等电点范围为6.79至9.95，其中CmABF4为酸性蛋白，其余8个蛋白pI>7。所有蛋白的GRAVY值均小于0，表明其为亲水性蛋白。所有蛋白的不稳定指数均高于40，表现为不稳定性。亚细胞定位预测显示9个CmABF蛋白均定位于细胞核。

**3.2 CmABF家族蛋白的多序列比对与系统发育树构建**

对来自6个物种（甜瓜、拟南芥、森林草莓、月季、桃和无油樟）的41个ABF基因氨基酸序列进行比对并构建系统发育树。ABF家族被划分为三个亚家族（Group A、B和C），其中Group A含1个CmABF（CmABF3），Group B含2个CmABFs（CmABF8和CmABF9），Group C含6个CmABFs（CmABF1、CmABF2、CmABF4、CmABF5、CmABF6和CmABF7）。

**3.3 CmABF基因的基因组分布与内含子-外显子结构**

CmABF基因在7条染色体上相对均匀分布，Chr01和Chr03各含2个基因，其余5条染色体各含1个。所有9个CmABF基因均含有内含子，外显子数目为2至4个不等：5个基因（CmABF3、CmABF4、CmABF6、CmABF7和CmABF8）有3个外显子，3个（CmABF1、CmABF5和CmABF9）含4个外显子，CmABF2含2个外显子。

**3.4 CmABF蛋白的保守结构域和基序组成**

MEME分析鉴定出7个保守基序（Motif 1–7），其中Motif 1在所有基因中高度保守存在，Motif 6仅在CmABF9中缺失。密切相关基因具有相似的基序组成。保守结构域分析显示所有CmABFs均含有bZIP结构域，表明CmABF家族高度保守。

**3.5 CmABF家族的顺式作用元件分析**

通过分析每个CmABF基因上游2000 bp区域，共预测到58个独特的顺式元件。所有CmABF基因均含有激素响应元件（如ABRE和GARE）和胁迫响应元件（如ARE和MBS）。CmABF8上游含有DRE/脱水响应元件。除CmABF4外的所有家族成员上游均存在W-box/WRKY元件。

**3.6 CmABF蛋白的预测相互作用网络**

蛋白质相互作用分析显示，CmABF1、CmABF3、CmABF4、CmABF5、CmABF6和CmABF8可与多个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（A0A5A7SZ03等）相互作用。鉴于SnRK2蛋白激酶可磷酸化ABF转录因子从而激活其转录活性，推测这些激酶可能发挥类似功能。

**3.7 CmABF基因的共线性关系及转录组表达模式**

种内共线性分析仅发现一对片段重复基因（CmABF3/CmABF6），无串联重复事件。种间分析显示甜瓜与拟南芥、森林草莓、番茄和桃分别共享7、5、5和6对共线性ABF基因。转录组表达模式分析表明，CmABF7在所有样品中均未检测到表达，可能为假基因或在未测试条件下表达。共表达相关性分析发现CmABF9的表达水平与大多数CAT和SOD基因呈正相关。

**3.8 CmABF家族的qRT-PCR表达分析**

qRT-PCR验证显示：臭氧处理对CmABF1、CmABF3和CmABF5无明显影响，但在7 d显著降低了CmABF2和CmABF4的表达，同时显著增加了CmABF9的表达。NDGA处理在7 d同样降低了CmABF2和CmABF4的表达，但在28 d和35 d显著提高了二者的表达水平。ABA处理在35 d除CmABF1、CmABF2和CmABF7外显著提高了所有家族成员的表达，并在28 d显著增加了CmABF9的表达。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，甜瓜CmABF基因家族成员数目与拟南芥一致（9个），明显少于经历过全基因组复制事件的大豆和葫芦。种内共线性分析仅确认一对片段重复基因，表明甜瓜ABF家族在进化历史上保持高度稳定。NDGA处理后CmABF2和CmABF4的表达变化模式与葡萄中VvABF2相似，表明内源ABA缺乏条件下可能发生补偿性反馈响应。

研究结论：通过全基因组生物信息学分析和表达谱鉴定，本研究系统分析了甜瓜CmABF基因家族的结构、进化及其在臭氧诱导的氧化胁迫、外源ABA施用和NDGA抑制ABA生物合成等多种采后处理下的响应特征。共鉴定出9个CmABF成员，均含有典型的bZIP保守结构域，定位于细胞核，表现出高度的系统发育保守性。通过对采后甜瓜进行臭氧、ABA和抑制剂处理，研究人员发现CmABF2、CmABF4、CmABF8和CmABF9是响应氧化胁迫和ABA信号的关键成员，其中CmABF9可能是臭氧诱导防御反应的早期响应因子。这些发现不仅丰富了对葫芦科植物ABA信号通路调控网络的理解，也为通过遗传工程提高甜瓜采后抗氧化能力、延长货架期提供了科学依据。该研究发表于《Horticulturae》期刊。