基于双水相萃取的核桃粕多糖生物活性分析与结构表征

《Applied Food Research》：Analysis of bioactivity and structural characterization of walnut meal polysaccharides based on aqueous two-phase extraction

　　

由于具有多种生物活性，多糖已成为研究热点。本研究采用超声辅助双水相萃取法从核桃粕中分离多糖。通过单因素试验和响应面优化试验确定了最佳提取参数，粗核桃粕多糖（walnut meal polysaccharides, WMP）的得率达到3.62 ± 0.15%。经分离纯化后，选取两个WMP组分（WMP-3和WMP-3a）用于后续实验研究。多种测定结果表明，源自核桃粕的多糖具有良好的抗氧化、降血糖和降血脂活性。结构表征测定显示，WMP-3a是一种高度均一的酸性多糖，其重均分子量（weight-average molecular weight, Mw）为80.6 kDa。该多糖在200°C下表现出良好的热稳定性，并具有无定形结构。通过单糖组成分析、甲基化分析和核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）分析发现，WMP-3a主要由→3)-β-D-Galp-(1→、→6)-β-D-Galp-(1→和→4)-β-D-GlcpA-(1→残基组成，其中→3,6)-β-D-Galp-(1→为主要分支位点。侧链由α-L-阿拉伯呋喃糖、α-L-吡喃鼠李糖和末端半乳糖残基构成。这些结构特征导致了核桃粕多糖的多种生物活性，从而为其进一步开发利用提供了理论基础。

核桃（*Juglans regia* L.）是全球最重要的坚果物种之一，中国供应量占全球40%以上。核桃加工产生大量核桃粕等副产物，其中含有蛋白质、维生素、脂肪、矿物质以及多糖、酚类、纤维素等活性成分，具有降血糖、抗氧化和预防心脑血管疾病等健康功效。目前大多数核桃粕仅用作动物饲料，资源利用率低。植物多糖因具有降血糖、降血脂、抗氧化和抗肿瘤等多种生物活性而成为天然药物和功能食品研究的热点。现有核桃副产物多糖研究主要集中于核桃壳、核桃果皮等，核桃粕多糖研究相对有限。常规热水提取存在高温导致多糖降解、耗时长、效率低和难以工业化等缺陷，而双水相体系（aqueous two-phase system, ATPS）可在常温下实现高效提取，具有能耗低、分相快、操作简便等优点。为此，研究人员首次采用超声辅助双水相萃取法提取核桃粕多糖，通过优化工艺建立高效、温和、环保的提取方案，并结合结构表征和体外活性实验阐明其构效关系，填补核桃粕多糖结构与活性相关性研究空白，提升核桃产业附加值。

研究人员以云南省临沧市凤庆县思银山农村专业合作社提供的漾濞泡核桃粕为原料。关键技术方法包括：超声辅助双水相萃取提取；单因素和响应面实验优化提取参数；DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-75凝胶柱层析进行分离纯化；体外抗氧化、降血糖和降血脂活性测定；采用单糖组成分析、高绩效凝胶渗透色谱（HPGPC）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、紫外光谱（UV）、热重分析（TG/DTG）、X射线衍射（XRD）、扫描电镜（SEM）以及甲基化分析和一维/二维核磁共振（NMR）进行结构表征。

研究结果显示：3.1 双水相体系筛选：比较六种由乙醇或异丙醇与K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、Na₂CO₃组成的双水相体系，乙醇-K₂HPO₄体系的核桃粕多糖得率最高。3.2 双水相相图绘制：浊度滴定法绘制的相图表明，该体系在较宽质量分数范围内可形成双水相，多糖因极性较大主要分配于下相，提取应在两相区内选择乙醇和K₂HPO₄的质量分数。3.3 单因素实验：多糖得率随K₂HPO₄质量分数和超声时间增加呈先升后降趋势，随乙醇浓度增加逐渐降低，温度过高会导致乙醇挥发和多糖变性，投料量为2 g时得率较高。3.4 响应面优化实验：四因素三水平响应面模型显著（P < 0.0001），R²=0.9872，各因素影响排序为超声温度>超声时间>乙醇浓度>K₂HPO₄浓度；最佳参数为K₂HPO₄质量分数23%、乙醇质量分数62%、超声时间42 min、超声温度31°C，实际得率3.62 ± 0.15%。3.5 分离纯化：DEAE-52柱层析获得五个组分，其中0.3 mol/L NaCl洗脱的WMP-3含量最高；经Sephadex G-75凝胶柱进一步分离得到WMP-3a和WMP-3b，以回收率较高的WMP-3a为后续研究对象。3.6 体外抗氧化活性：WMP、WMP-3和WMP-3a对DPPH自由基、ABTS⁺自由基、羟基自由基的清除能力和总还原力均呈浓度依赖性增强，其中WMP-3a的IC₅₀