《Horticulturae》：CRISPR/Cas9-Mediated Dual Editing of BcSGR1 and BcSGR2 Exerts Additive Enhancement on Delaying Leaf Senescence in Non-Heading Chinese Cabbage
编辑推荐：
叶片衰老对不结球白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）的产量和采后品质产生负面影响，而STAY-GREEN（SGR）同源基因BcSGR1和BcSGR2是叶绿素降解的核心调控因子。本研究利用四个高效、高特异性的单向导RNA（sgRNA）
叶片衰老对不结球白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）的产量和采后品质产生负面影响，而STAY-GREEN（SGR）同源基因BcSGR1和BcSGR2是叶绿素降解的核心调控因子。本研究利用四个高效、高特异性的单向导RNA（sgRNA）构建了CRISPR/Cas9单基因和双基因编辑载体。通过使用带柄子叶外植体并添加6 mg·L?1 AgNO?优化遗传转化体系，研究人员获得了26%的PCR阳性转化效率（该数值反映转化效率；各突变株系的实际基因编辑效率见靶向测序结果），并获得了BcSGR1（YB1）和BcSGR2（YB2）单突变体以及BcSGR1/BcSGR2双突变体（DKO）。所有突变株系均表现出明显的滞绿表型和延迟的叶片衰老。DKO株系的叶绿素含量为野生型的3.15倍，丙二醛（MDA）含量仅为野生型的四分之一，表明双基因敲除具有加性增强效应。与野生型（3天货架期）相比，YB1、YB2和DKO的采后保鲜期分别延长至7天、8天和11天，衰老分别延迟15天、18天和22天。值得注意的是，YB1和YB2在发育后期表现出轻度叶片皱缩，而DKO保持正常叶片形态。综上，研究结果表明，BcSGR1和BcSGR2的双基因编辑对延缓叶片衰老具有加性效应，并在实验条件下无需显著牺牲产量即可延长采后货架期。该研究为培育不结球白菜滞绿品种提供了可行且有效的策略。
论文解读：CRISPR/Cas9双基因编辑BcSGR1与BcSGR2对不结球白菜叶片衰老的加性延缓效应
一、研究背景与科学问题
不结球白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）是我国广泛栽培的重要叶菜类蔬菜，在保障全年蔬菜供应中发挥关键作用。然而，叶片衰老引起的品质劣变严重损害其商业价值。该作物在采后极易失水萎蔫，叶片黄化是品质下降的首要原因，常温贮藏仅4天即失去商品性，造成重大经济损失。现有采后保鲜策略主要依赖物理和化学处理，如低温贮藏和1-甲基环丙烯（1-MCP）熏蒸。虽然这些处理可在一定程度上延长货架期，但存在运营成本高、不同品种和条件下效果不稳定等问题，且最根本的是未能从遗传层面解决叶片黄化的根源。因此，鉴定核心衰老调控基因并通过遗传改良主动调控衰老进程，成为突破现有保鲜瓶颈的关键研究方向。
STAY-GREEN（SGR）基因家族已被证实是调控叶绿素降解和叶片衰老进程的核心调控因子。在拟南芥和水稻中的研究确立了SGR作为叶片衰老主要正调控因子的地位。对茶树等园艺作物SGR基因家族的全基因组鉴定揭示了旁系同源基因间的功能分化：SGR1仅定位于叶绿体，而SGR2和SGRL呈现更广泛的亚细胞分布模式。在拟南芥中，SGR1加速叶绿素降解，其功能缺失突变显著延缓叶片黄化；相反，SGR2与SGR1异源二聚化抑制其活性，发挥负调控因子作用。尽管这一主要来源于拟南芥的调控模型暗示同时敲除SGR1和SGR2可能带来有限的实用价值并扰乱整体叶绿素代谢网络，但该范式是否适用于不结球白菜尚不清楚。近年来，CRISPR/Cas9基因组编辑技术凭借其高精度和高编辑效率，已在芸薹属作物中成功应用于加速基因功能表征和性状改良。已有研究报道了白菜和青菜中与SGR1相关的滞绿突变体，但BcSGR2的生物学功能及其与BcSGR1的潜在互作仍不清楚。研究人员假设不结球白菜中的BcSGR2可能与其拟南芥直系同源基因发生了功能分化，且同时破坏BcSGR1和BcSGR2可能对衰老调控产生加性增强效应。
二、研究内容与主要技术方法
该研究发表于《Horticulturae》。研究人员利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统，系统阐明了BcSGR1和BcSGR2在不结球白菜叶片衰老中的调控作用，重点研究了双基因同时诱变带来的加性效应。研究者以不结球白菜优良品种‘苏州青’为受体材料（由南京农业大学三亚研究院蔬菜遗传育种实验室提供无菌苗），开展了以下工作：设计靶向BcSGR1和BcSGR2的高特异性sgRNA并构建高效CRISPR/Cas9单基因和双基因编辑载体；通过优化的农杆菌介导遗传转化体系获得BcSGR1单敲除、BcSGR2单敲除和双敲除突变体；测定与叶片衰老和氧化胁迫相关的生理参数，进行单突变体、双突变体与野生型间的差异比较分析。
主要关键技术方法包括：（1）基于NCBI数据库中不结球白菜SGR1（Bra020829）和SGR2（Bra000755）编码区序列，利用CRISPR-P 2.0设计候选sgRNA，通过Cas-OFFinder进行全基因组脱靶预测（允许错配数≤3），并经体外切割效率测定筛选切割效率>85%的高效高特异性sgRNA；（2）采用Golden Gate组装法构建单基因和双基因编辑载体（pYLCRISPR/Cas9-BcSGR1、pYLCRISPR/Cas9-BcSGR2和pYL-Cas9-S1S2）；（3）农杆菌介导的遗传转化：以带柄子叶和下胚轴为外植体，经预培养、农杆菌侵染、共培养后转入添加6 mg·L?1 AgNO?的选择性再生培养基诱导不定芽，30天后转至生根培养基获得完整再生植株。设置了外植体类型与AgNO?添加与否的四种比较处理，每种处理使用不少于120个外植体，进行三次独立转化实验；（4）突变体筛选与鉴定：提取再生植株基因组DNA，PCR扩增Cas9基因进行初筛，对Cas9阳性植株的靶位点区域进行PCR扩增和Sanger测序，通过序列比对分析突变类型，鉴定BcSGR1单突变体（YB1）、BcSGR2单突变体（YB2）和双突变体（DKO）；（5）表型与生理指标测定：叶绿素含量采用95%乙醇提取法测定，丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定，超氧阴离子自由基（O??）产生速率和过氧化氢（H?O?）含量亦被测定；株高、最大叶面积和单位面积产量用于评估基因编辑对主要农艺性状的影响。统计分析采用SPSS 26.0，单因素方差分析结合Tukey HSD检验（p < 0.05），并通过加性期望模型（E_add = YB1 + YB2 ? Y_WT）和双因素方差分析评估双突变的加性效应。
三、主要研究结果
3.1 sgRNA的筛选与编辑载体的构建
体外切割活性测定证实所有四个候选sgRNA的切割效率均超过85%，其中BcSGR2-sgRNA1活性最高达93%。全基因组脱靶预测显示每个sgRNA最多有两个推定脱靶位点，且均位于基因间非编码区，表明靶向特异性良好。限制性内切酶酶切和Sanger测序验证成功组装了三个CRISPR/Cas9构建体：单靶标编辑质粒pYLCRISPR/Cas9-BcSGR1和pYLCRISPR/Cas9-BcSGR2，以及双基因编辑载体pYL-Cas9-S1S2。
3.2 再生体系的优化
对于添加6 mg·L?1 AgNO?的培养基上培养的带柄子叶外植体，褐变率为15 ± 5%，不定芽诱导率为38 ± 6.5%，PCR验证的转基因效率为26 ± 2.9%。对于未添加AgNO?的下胚轴外植体，褐变率为65 ± 12%，转化效率仅为3.1 ± 1.5%。表明带柄子叶结合AgNO?处理的组合显著优化了遗传转化效率。
3.3 阳性突变植株的分子鉴定
从组织培养中回收了21个独立再生株，其中18个经PCR筛选获得Cas9转基因诊断性扩增产物，总转基因回收率为85.71%。靶位点Sanger测序鉴定出9个在BcSGR1位点携带单等位基因编辑的独立株系。Hi-TOM扩增子测序在sgRNA1靶位点未发现序列变异，但在sgRNA2切割位点下游检测到单碱基插入，野生型读段占测序池的62.90%，1 bp插入变体占37.10%。该sgRNA2结合基序位于BcSGR1高度保守的编码结构域内。靶向BcSGR2的株系中 recovered 出9个BcSGR2单突变体分离株。3个再生株携带双基因敲除特征性组合损伤，即在BcSGR1中具有与YB1相同的1 bp插入，在BcSGR2中具有与YB2相同的4 bp缺失。所有鉴定的等位变异预计在BcSGR1或BcSGR2编码区产生移码突变，导致截短且可能无功能的蛋白质。
3.4 编辑植株的叶片衰老与货架期表型
田间表型分析显示，野生型和突变体在田间条件下均保持鲜绿色叶片。YB1和YB2单突变体在发育后期表现出一定程度的叶片皱缩，而DKO双突变体显示正常叶片形态。常温贮藏条件下采后货架期测定进一步量化了叶片黄化进程的差异。野生型叶片在采后3天达到50%黄化覆盖，完全丧失商品品质；而YB1、YB2和DKO的功能叶片在3天后黄化仍低于20%，表明黄化起始延迟。在20天时，YB1和YB2的功能叶片黄化约80%，而DKO仅约60%。两单突变体间贮藏寿命无统计学显著差异。双突变体比单突变体更大程度地减缓叶绿素降解。
3.5 编辑植株的生理指标变化
所有突变基因型的总叶绿素浓度相对于野生型对照均显著升高。YB1和YB2的叶绿素浓度分别达到野生型的1.4倍和1.5倍，而DKO的叶绿素积累量为野生型的3.15倍，远超两个单基因突变的加性期望值，体现了双基因同时破坏后显著的加性增强效应（t检验证实）。MDA含量测定结果相反：野生型MDA浓度显著高于所有突变株系，野生型MDA水平接近DKO叶片的四倍。YB1和YB2的MDA水平相当。所有突变株系的O??产生速率和H?O?含量均显著低于野生型。YB1和YB2的O??产生速率分别为野生型的73.4%和66.0%，H?O?含量分别为71.4%和63.8%；DKO的O??产生速率和H?O?含量最低，仅为野生型的33.7%和33.0%。双因素方差分析显示BcSGR1和BcSGR2的主效应及其交互作用对叶绿素含量均显著，与加性期望分析完全一致。失重率测定显示所有材料的失重率随贮藏时间呈上升趋势，野生型在贮藏5天后急剧上升，10天时达31%；而编辑株系失重率显著较低，DKO在10天时仅为约14%。
3.6 编辑植株的农艺性状分析
核心农艺性状测定显示，YB1、YB2、DKO突变体与野生型对照在株高、最大叶面积和单株重方面无统计学显著差异。DKO基因型株高为24.2 ± 2.3 cm，最大叶面积为141.2 ± 10.2 cm2，产量为131.95 ± 6.37 g。表明在该实验条件下，BcSGR1和BcSGR2的靶向诱变主要调控叶片滞绿特性，对不结球白菜优良农艺性状无检测到的不利影响。
四、讨论与结论
讨论部分主要围绕以下几个方面展开：第一，BcSGR1和BcSGR2诱变对不结球白菜滞绿表型的功能调控。与拟南芥中AtSGR2的经典负调控作用相反，单独破坏BcSGR2即显著提高叶片叶绿素丰度并延长采后贮藏性，表明BcSGR2直系同源基因在芸薹科物种间存在实质性的功能分化，BcSGR2可能作为叶绿素周转的核心介质。第二，双BcSGR编辑的加性增强效应的可能机制。双敲除基因型的滞绿性能远强于任一单突变等位基因，可能与重复SGR旁系同源基因在叶绿素分解代谢中的功能分化和互补作用有关。研究人员推测BcSGR1和BcSGR2可能组装成功能性同源或异源二聚体复合物共同调控叶绿素降解，双基因诱变将完全消除该蛋白复合物的形成从而阻断叶绿素分解，而单基因敲除仅部分削弱复合物活性。第三，优化再生与转化流程。通过系统筛选最佳外植体材料和外源添加硝酸银，将PCR阳性转化效率提升至26%，优于此前优化的甘蓝转化体系（19.33–20.00%）。第四，研究局限性方面，脱靶评估仅基于计算预测缺乏实验验证；表型数据均来自T0再生株，编辑等位基因在后代中的遗传性和稳定性有待验证；未进行转录水平或蛋白质水平验证，也未检测下游叶绿素分解代谢基因的表达变化；农艺评价仅在单一环境条件下进行。第五，CRISPR基因组编辑用于不结球白菜遗传改良的转化潜力，该双编辑种质在测试条件下表现出延缓叶片衰老和延长采后贮藏性而不损害优良农艺性能的特征。
研究结论：本研究建立了高效的再生体系（26% PCR阳性转化效率），在不结球白菜中实现了BcSGR1和BcSGR2的双重CRISPR/Cas9编辑，发挥显著的加性增强效应，使叶绿素含量提高3.15倍，延缓叶片黄化并减轻农艺性状损失。这些发现为BcSGR1和BcSGR2在调控叶片衰老中的互作提供了证据，并为培育滞绿品种提供了可行策略。
