一种用于基础研究和诊断的多功能抗CXCR5单克隆抗体（Cx5Mab-6）

《Current Issues in Molecular Biology》：A Versatile Anti-CXCR5 Monoclonal Antibody (Cx5Mab-6) for Basic Research and Diagnosis

　　

摘要：G蛋白偶联受体CXC趋化因子受体5（CXCR5）主要表达于次级淋巴组织中的B细胞、滤泡辅助性T细胞以及淋巴瘤细胞。其与配体CXCL13的结合可介导细胞迁移并调控淋巴细胞归巢。CXCL13/CXCR5的异常表达和信号转导与肿瘤进展、自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病密切相关。因此，针对CXCR5的特异性单克隆抗体有望用于诊断和治疗应用。在本研究中，研究人员通过基于流式细胞术的高通量筛选开发出新型抗人CXCR5单克隆抗体（Cx5Mabs）。其中一株克隆Cx5Mab-6（IgG2b，κ）能够识别过表达CXCR5的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）-K1细胞，但在流式细胞术中不与其他五种过表达CXCR受体的CHO-K1细胞反应。此外，Cx5Mab-6可识别人Burkitt淋巴瘤Raji细胞系中的内源性CXCR5。Cx5Mab-6与CHO/CXCR5和Raji的解离常数（dissociation constant，KD）分别为3.4 × 10^?9 M和1.2 × 10^?10 M。进一步研究表明，Cx5Mab-6适用于Western blotting，并可通过免疫组织化学检测人淋巴瘤组织中的CXCR5。这些发现表明，Cx5Mab-6在基础研究中具有多功能性，并在临床诊断中具有潜在应用价值。

论文解读：基于CBIS方法开发的多功能抗CXCR5单克隆抗体Cx5Mab-6及其应用价值

趋化因子及其受体系统在淋巴细胞增殖、分化、组织分布及免疫应答中发挥关键作用。CXC趋化因子受体5（CXCR5），又称Burkitt淋巴瘤受体1，主要表达于次级淋巴组织中的正常B细胞、滤泡辅助性T细胞及淋巴瘤细胞。CXCR5与其配体CXCL13结合后介导细胞迁移，在淋巴细胞归巢中发挥重要调控功能。CXCL13由滤泡树突状细胞、滤泡辅助性T细胞、巨噬细胞和上皮细胞等多种细胞产生，在次级淋巴组织中通过招募B细胞进入滤泡来组织淋巴样结构，并在生发中心引导Tfh和B细胞定位，协助B细胞亲和力成熟及分化为长寿命浆细胞或记忆B细胞。近年研究表明，CXCL13-CXCR5轴参与多种自身免疫性疾病和肿瘤的发病过程。在类风湿关节炎中，CXCL13促进内皮祖细胞招募和血管内皮生长因子表达，从而促进滑膜血管生成；在狼疮性肾炎中，CXCL13刺激系膜细胞增殖和足细胞促炎介质分泌；炎症性肠病（IBD）患者血清CXCL13水平显著升高，CXCL13缺陷可抑制结肠炎发展。此外，CXCR5在多种B细胞淋巴瘤和部分T细胞淋巴瘤以及肺癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等实体瘤中均有表达，CXCL13-CXCR5轴通过激活磷脂酰肌醇3-激酶、Raf/MEK/ERK、局部黏着斑激酶/paxillin和DOCK2/Rac/JNK等多条信号通路促进肿瘤增殖和侵袭。因此，CXCR5被认为是具有前景的治疗靶点，开发能够特异性识别CXCR5的抗体对于基础研究和疾病诊断具有重要意义。

基于此研究背景，研究人员采用基于细胞免疫和筛选（Cell-Based Immunization and Screening，CBIS）方法开发新型抗人CXCR5单克隆抗体。以过表达CXCR5的CHO-K1细胞（CHO/CXCR5）为免疫原，免疫BALB/cAJcl小鼠，通过杂交瘤技术获得单克隆抗体。经流式细胞术和Western blotting等验证，筛选出克隆Cx5Mab-6（IgG2b，κ）。研究表明，Cx5Mab-6在流式细胞术中可特异性识别外源性和内源性CXCR5，不与CXCR家族其他成员发生交叉反应；其与CHO/CXCR5和Raji细胞的解离常数（KD）分别为3.4 × 10^?9 M和1.2 × 10^?10 M，显示出较高的结合亲和力。Cx5Mab-6还可用于Western blotting和免疫组织化学检测。该论文发表在《Current Issues in Molecular Biology》。

研究人员在技术创新方面采用了以下主要关键技术方法：首先采用CBIS方法进行抗体开发，以CHO/CXCR5细胞免疫BALB/cAJcl小鼠，利用流式细胞术进行高通量杂交瘤筛选；其次通过流式细胞术评估抗体的反应性和特异性，并测定抗体与过表达及内源性CXCR5细胞的KD值；同时利用Western blotting检测变性条件下的CXCR5蛋白；最后使用全自动免疫组织化学染色系统（VENTANA BenchMark ULTRA PLUS）对人淋巴瘤组织芯片和福尔马林固定石蜡包埋细胞块进行免疫组织化学检测。细胞系来源方面，CHO-K1、人胶质母细胞瘤LN229和小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1（P3U1）细胞系购自美国典型培养物保藏中心，人Burkitt淋巴瘤Raji细胞系购自日本理化研究所生物资源研究中心，人淋巴瘤组织芯片（LM241b）购自US Biomax公司。

研究结果部分的主要发现如下：

采用CBIS方法开发抗CXCR5单克隆抗体：研究人员以CHO/CXCR5免疫BALB/cAJcl小鼠，经五次免疫后取脾细胞与P3U1骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤。通过流式细胞术以LN229/CXCR5为阳性筛选、亲本LN229为阴性筛选，从958孔中鉴定出13个阳性孔（1.4%），经有限稀释克隆后最终获得Cx5Mab-5、Cx5Mab-6和Cx5Mab-7三株抗体。经反应性、特异性和多种应用验证后，选择Cx5Mab-6（IgG2b，κ）进行后续实验。

Cx5Mab-6和J252D4对CXCR5过表达细胞的流式细胞术分析：Cx5Mab-6在10至0.01 μg/mL浓度范围内以剂量依赖性方式识别CHO/CXCR5细胞，但不与亲本CHO-K1细胞反应。商品化抗CXCR5单克隆抗体J252D4表现为类似的反应模式。两种抗体均可识别LN229/CXCR5而不识别LN229，证明Cx5Mab-6对外源过表达CXCR5具有特异性识别能力。

利用过表达CXCRs的CHO-K1分析Cx5Mab-6的特异性：研究人员建立了分别过表达CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5和CXCR6的CHO-K1细胞系。流式细胞术结果显示，Cx5Mab-6仅与CHO/CXCR5反应，不与其他五种CXCR过表达细胞发生交叉反应，证实了Cx5Mab-6在CXCR家族成员中对CXCR5具有高度特异性。

Cx5Mab-6和J252D4对内源性CXCR5表达细胞系的流式细胞术分析：Cx5Mab-6在1至0.01 μg/mL浓度范围内以剂量依赖性方式识别内源性表达CXCR5的人Burkitt淋巴瘤Raji细胞，而同种型对照IgG2b抗体RdMab-20在1 μg/mL浓度下不识别Raji细胞。J252D4也识别Raji细胞，同种型对照CvMab-62无反应，证明Cx5Mab-6能够检测天然构象下的内源性CXCR5。

Cx5Mab-6与CXCR5阳性细胞结合亲和力的测定：通过流式细胞术拟合结合曲线，测得Cx5Mab-6与CHO/CXCR5和Raji结合的KD值分别为3.4（±0.8）× 10^?9 M和1.2（±0.3）× 10^?10 M，而J252D4的KD值分别为1.6（±0.3）× 10^?8 M和1.1（±0.1）× 10^?8 M。结果表明Cx5Mab-6对外源性和内源性CXCR5均具有比商品化抗体更高的结合亲和力。

使用Cx5Mab-6和J252D4进行的Western blotting分析：在还原条件下，Cx5Mab-6能够在CHO/CXCR5细胞裂解液中检测到60和120 kDa两条主要条带，而CHO-K1中无信号。J252D4虽显示相似条带模式但强度较弱。以异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）抗体RcMab-1-mG1作为内参对照。这表明Cx5Mab-6适用于Western blotting检测变性CXCR5蛋白，并且灵敏度优于J252D4。

使用Cx5Mab-6和J252D4在福尔马林固定石蜡包埋细胞块中的免疫组织化学分析：Cx5Mab-6和J252D4在CHO/CXCR5细胞块中均呈现强膜性和胞质性染色，而CHO-K1无染色信号。表明Cx5Mab-6适用于福尔马林固定石蜡包埋标本的免疫组织化学检测。

使用Cx5Mab-6在福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织中的免疫组织化学分析：在淋巴瘤组织芯片中，Cx5Mab-6在扁桃体淋巴滤泡和浆细胞性淋巴瘤病例中呈现阳性染色，而同种型对照抗体无阳性信号。在弥漫性大B细胞淋巴瘤和弥漫性T细胞淋巴瘤中也观察到类似染色结果。证明Cx5Mab-6可用于检测福尔马林固定石蜡包埋的人淋巴瘤组织中的内源性CXCR5。

讨论部分指出，Cx5Mab-6在流式细胞术中可特异性识别CXCR5阳性细胞，适用于通过荧光激活细胞分选进行细胞分离。CXCR5表达于CD4⁺滤泡辅助性T细胞和具有B细胞辅助功能的CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞亚群。CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞在慢性感染抗病毒免疫中具有重要作用，并与人扁桃体中针对潜伏性EBV抗原的特异性CD8⁺ T细胞富集相关，且具有PD-1⁺干细胞样组织驻留表型。通过多标记染色技术，Cx5Mab-6有助于在免疫组织化学中鉴定CXCR5⁺ CD4⁺ T细胞或CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞。肿瘤免疫微环境中CXCR5⁺ CD8⁺ T细胞的存在与肺癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌和结直肠癌患者更好的总生存期相关，且部分肿瘤中该类细胞的存在指示对免疫检查点阻断疗法具有良好响应性。因此，Cx5Mab-6可能有助于预测免疫检查点阻断治疗的反应性。此外，CXCR5基因座（11q23.3，DDX6-CXCR5位点）的单核苷酸多态性与干燥综合征（SjD）和系统性红斑狼疮（SLE）等自身免疫性疾病的易感性相关，Cx5Mab-6可用于检测SjD和SLE中异常B细胞活化和异位淋巴样组织形成，可能为相关疾病诊断提供帮助。关于Western blotting检测到的60和120 kDa条带，结合既往研究和糖基化抑制剂实验结果提示，CXCR5的N-糖基化修饰可能参与了高分子量条带的形成。

结论部分总结指出，Cx5Mab-6是通过CBIS方法开发的新型抗CXCR5单克隆抗体，可应用于流式细胞术、Western blotting和免疫组织化学等多种实验技术。因此，Cx5Mab-6在基础研究和临床诊断中具有广泛的实用价值。虽然已确认其在CXCR家族成员中的特异性，但与其他G蛋白偶联受体的交叉反应性尚未系统评估，抗体的抗原表位和生物学活性也尚未确定。目前Cx5Mab-6的cDNA克隆工作正在进行中，这将有助于重组抗体的制备或嵌合抗原受体（CAR）的开发，为肿瘤治疗提供新策略。