噬菌体vB_KpnM_NB鸡尾酒与阿米卡星协同抑制肺炎克雷伯菌持留菌

《Applied and Environmental Microbiology》：Phage vB_KpnM_NB cocktail synergizing with amikacin in inhibiting persister cells of Klebsiella pneumoniae

　　

多重耐药肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, KPN）和抗生素耐受持留菌的出现对现有抗感染治疗构成了重大挑战。鉴于对可持续抗生素替代品的迫切需求，噬菌体鸡尾酒正成为控制肺炎克雷伯菌感染的一种有前景的替代方案。研究人员从宁波环境样本中分离出三株裂解性噬菌体vB_KpnM_NB（1–3），将其归类为Drexlerviridae家族，并确定了其中两株代表性噬菌体的生物学特性。基因组分析证实，这些噬菌体亲缘关系密切，且缺乏耐药性和毒力基因，确保了生物安全性。随后，利用阿米卡星建立了稳定的肺炎克雷伯菌持留菌模型，在治疗过程中观察到双相杀伤模式。在感染复数（multiplicity of infection, MOI）为10时，噬菌体鸡尾酒清除了99.00%的持留菌，而单一噬菌体的效果较差。噬菌体鸡尾酒还抑制了持留菌来源的生物被膜形成，与阿米卡星联用时效果更好。这种联合处理显著减少了持留菌的荚膜多糖产生，削弱了外膜屏障。这些发现表明，噬菌体鸡尾酒-阿米卡星联合方案可有效靶向浮游细胞、持留菌和生物被膜，为对抗持留菌和复发性肺炎克雷伯菌感染提供了一种有前景的策略。

重要性：这项研究填补了理解噬菌体鸡尾酒与阿米卡星协同作用于肺炎克雷伯菌持留菌方面的关键空白。通过构建高度特异性的噬菌体vB_KpnM_NB鸡尾酒、建立稳定的持留菌模型并进行体外杀菌和生物被膜测定，研究人员证明该鸡尾酒能有效清除浮游细胞、持留菌和生物被膜。研究人员阐明了核心协同机制：抑制荚膜多糖合成、改善噬菌体吸附以及破坏细菌外膜屏障。这些发现为多重耐药和碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌持留菌感染的预防和控制提供了实验证据，建立了一种安全有效的噬菌体-抗生素联合疗法。该结果对于解决抗生素耐受性和控制慢性复发性感染至关重要。它们对临床难治性感染的治疗具有重要的理论和转化价值，并为开发新型抗菌策略提供了新见解。

多重耐药肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae, KPN）和抗生素耐受性持留菌的出现使现有抗感染治疗面临严峻挑战。在中国，KPN是临床分离株中第二大病原体，其碳青霉烯耐药率从2005年的3%升至2023年的30%，多重耐药甚至泛耐药菌株使常规抗生素失效。此外，持留菌是不携带遗传耐药突变但能耐受高浓度抗生素的休眠亚群，具有双相杀伤特征，可在停药后复苏，导致慢性感染和复发。传统抗生素对持留菌效果不佳，亟需可持续替代策略。噬菌体鸡尾酒作为多靶点、广谱的抗菌策略显示出潜力，但此前关于其单独或与抗生素协同抑制KPN持留菌的研究有限，机制不明。在这项发表于《Applied and Environmental Microbiology》的研究中，研究人员从宁波河水和生活污水中分离出三株裂解性噬菌体vB_KpnM_NB（1–3），构建噬菌体鸡尾酒，并与阿米卡星联用，系统评估其对浮游细胞、持留菌和生物被膜的抑制效果及机制，证明该联合策略能有效清除持留菌，为治疗难治性KPN感染提供理论依据。

研究人员以来自宁波大学附属医院的KPN临床分离株XU1（ST11，荚膜型K2）为宿主菌，从宁波河水和生活污水中分离噬菌体，经透射电镜观察形态、全基因组测序和生物信息学分析确认分类与安全性，并测定其温度、pH稳定性、最佳感染复数（multiplicity of infection, MOI）、吸附曲线和一步生长曲线。通过spot test和效率铺板（efficiency of plating, EOP）测定宿主范围。利用VITEK 2和肉汤稀释法测定抗生素敏感性，以10×MIC阿米卡星诱导持留菌，通过双相杀伤曲线、二次暴露、ATP测定和光学显微镜验证持留菌表型。随后比较单一噬菌体和噬菌体鸡尾酒对正常菌和持留菌的体外杀菌活性，通过结晶紫染色和共聚焦激光扫描显微镜评估生物被膜抑制和清除，并用硫酸-苯酚法定量荚膜多糖（capsule polysaccharide, CPS）含量。

**形态学表征（Morphological characterization of phage vB_KpnM_NB）**：透射电镜显示三株噬菌体均具典型二十面体头部和非收缩性尾部，符合Drexlerviridae家族特征；vB_KpnM_NB1和NB2头部直径约60 nm、尾长约110 nm，vB_KpnM_NB3头部较大（79.34±5.24 nm）、尾较长（124.58±10.12 nm），并具基板和尾纤维结构。

**基因组分析（Genomic analysis）**：全基因组测序显示三株噬菌体基因组长度约47–50 kb，GC含量49%–52%，不含tRNA基因、整合酶、重组酶或阻遏蛋白基因，也无耐药或毒力基因，表明其为严格裂解性噬菌体且具生物安全性。系统发育树显示三者以99%–100%的bootstrap值紧密聚为一支，亲缘关系极近。

**噬菌体的生物学特性（Biological characteristics of phage vB_KpnM_NB）**：两株噬菌体在4–37°C稳定，50°C显著失活；vB_KpnM_NB1在70°C完全失活，vB_KpnM_NB2在60°C完全失活。pH稳定性方面，vB_KpnM_NB1在pH 10活性最高，vB_KpnM_NB2在pH 7最高，两者均在pH 3失活。吸附实验显示20 min内约89%的噬菌体吸附宿主。一步生长曲线显示vB_KpnM_NB1潜伏期110 min、裂解量196.88±41.83 PFU/细胞，vB_KpnM_NB2潜伏期100 min、