混合酸发酵过程中平衡细胞内甲酸水平对胞内pH（pHi）与CO2稳态的重要性

《Journal of Bacteriology》：Importance of balanced intracellular formate levels for pHi and CO2 homeostases during mixed-acid fermentation

　　

在混合酸发酵过程中，大肠杆菌（Escherichia coli）将葡萄糖代谢为乙酸、乙醇、甲酸、乳酸与琥珀酸的混合物，同时伴随等摩尔量的H2与CO2生成。这些气体由甲酸经甲酸氢解酶（FHL-1）歧化反应产生，该反应为细胞提供其唯一的内部来源CO2以供给羧化反应。甲酸由丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）生成，其细胞内平衡水平由PflB、FHL-1及双向甲酸通道FocA的活性共同维持。当菌株合成FocAN209变体持续高效地外排甲酸时，便会出现甲酸失衡。在发酵生长中，产FocAN209菌株过早进入稳定期，并因胞内甲酸不足而无法合成FHL-1。本研究表明，相较于亲本菌株，突变体的胞内pH（pHi）升高，且与ATP水平降低相关。厌氧生长可通过添加碳酸氢盐部分恢复，但pHi仅轻微下降，ATP水平依旧低下。发酵产物谱测定显示，细胞持续丢失甲酸无法被碳酸氢盐补充所补偿。乳酸与琥珀酸生成的严重受限也仅被碳酸氢盐部分挽救。乙醇产量增加表明突变体中乙酰-CoA被牺牲以重新氧化还原型吡啶核苷酸。这些发现证明，胞内甲酸失衡不仅负面影响了羧化代谢，还重塑了发酵产物谱，损害细胞能量代谢与pH稳态。

研究背景与立项依据：在肠杆菌混合酸发酵中，丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）将丙酮酸非氧化裂解为乙酰-CoA与甲酸，甲酸再经甲酸氢解酶复合体（FHL-1）歧化为CO₂与H₂，为细胞提供内部CO₂源以驱动乙酰-CoA羧化酶（ACC）与磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）等羧化反应，并参与厌氧核糖核苷酸还原。胞内甲酸水平由PflB生成、FHL-1消耗及双向通道FocA重导入/外排共同维系。此前已知FHL-1缺失株因无内部CO₂致生长与稳期存活缺陷，且可被碳酸氢盐挽救；而合成FocA_N209变体（H209N）的菌株虽持续高效外排甲酸、胞内甲酸过低而缺FHL-1、生长严重受限，但其表型不能被碳酸氢盐完全挽救的机制尚未阐明。该研究即围绕“甲酸失衡如何连锁破坏CO₂供给、pH_i、ATP及发酵重编程”展开，论文发表于《Journal of Bacteriology》。

主要关键技术方法：研究以大肠杆菌DH4100（WT）、DH4200（FocAH209N，染色体focA-H209N）、DH4300（FocAT91A，focA-T91A）同基因背景菌株为队列，在M9-葡萄糖厌氧培养基（pH7、pH8、pH7+50mM NaHCO₃）中培养；采用荧光探针BCECF-AM测胞内pH（pH_i）、荧光素酶法测胞内ATP、膜泡Pi释放法（DCCD抑制区分）测F₁F_o-ATP酶活力、TPP⁺分布法算膜电位（ΔΨ）与质子动势（pmf）、fdhF_P::lacZ报告法间接反映胞内甲酸对FhlA激活程度、HPLC定量胞外有机酸、气相色谱定H₂/CO₂顶空累积量。

研究结果

高碳酸氢盐浓度部分恢复FocAH209N发酵生长缺陷：在pH7 M9-葡萄糖中FocAH209N终密度仅为WT约半，加50mM NaHCO₃后比生长速率略升、终密度增75%，但仍低于WT；pH8培养改善程度不及碳酸氢盐，证明外源HCO₃^-/CO₂可部分补偿而非逆转甲酸流失代价。

FocA依赖排甲酸缺陷株FocAT91A生长似亲本：该株胞内积甲酸、pH_i恒6.8、对碳酸氢盐响应弱于WT但生长略优，反证维持正常胞内甲酸水平即可保pH_i与生长。

FocAH209N的ATP浓度在50mM碳酸氢盐厌氧培养下未恢复至野生型水平：WT ATP稳期达1.4μM OD₆₀₀^-1，FocAH209N仅约400nM OD₆₀₀^-1且在加碳酸氢盐时仍不回升，FocAT91A与WT相近且略高。

FocAH209N葡萄糖发酵中pH_i恒定7.0：WT从7.0降至稳期6.7，FocAT91A恒6.8，FocAH209N恒略超7.0，低ATP与高pH_i呈反比，类同FHL-1缺失表型。

FocAH209N中F₁F_o-ATP酶活力增强：膜泡总ATP酶及F₁F_o贡献在指数与稳期均较WT高约2–3.7倍，解释胞内ATP被水解供质子外排。

FocAH209N生长中ΔpH升高由ΔΨ调整补偿：指数期ΔpH较WT高3–5倍，但ΔΨ相应变正使pmf维持近-200mV以上，稳期三株pmf均约-213至-265mV。

碳酸氢盐对排甲酸突变体pH_i的影响：加50mM HCO₃^-培养12h后FocAH209N pH_i6.92（未回6.8），WT/FocAT91A仍6.8左右，说明pH_i偏高0.1即足以驱动ATP酶水解。

FocAH209N胞内甲酸严重受限：fdhF_P::lacZ报告活性近乎零，加碳酸氢盐仍仅~50 Miller单位（WT~400，FocAT91A~800），顶空H₂仅WT的约12%，证FHL-1不被诱导。

碳酸氢盐提高FocAH209N稳期胞外甲酸：其胞外甲酸在指数后期高于WT，稳期与外源HCO₃^-下接近WT，但胞内仍空。

FocAH209N发酵产物谱大改：稳期乳酸0.4mM OD₆₀₀^-1（WT~1.5）、琥珀酸~2mM（WT~4.5–5）、乙酸~6mM，乙醇较WT高~50%，显示乙酰-CoA被AdhE耗于再生NAD⁺而非走PTA-AckA产ATP。

碳酸氢盐增加FocAH209N有机酸：加HCO₃^-后乙酸、琥珀酸升，乙醇降约半但未达WT，证明PPC羧化获补但甲酸流失引发的重定向不可逆。

讨论与结论翻译：大肠杆菌缺失FHL-1的稳期表型直接源于胞内CO₂不足与ATP降低；FocAH209N因FocA_N209单向排甲酸致FHL-1不诱导、CO₂匮缺、pH_i偏高、F₁F_o-ATP酶水解增强、ATP低、膜不稳，并因PflB持续裂解丙酮酸竞争过LdhA使乳酸/琥珀酸低，迫使乙酰-CoA流向乙醇以平衡氧化还原，底物水平磷酸化产ATP更少。外源碳酸氢盐可部分补羧化反应、延滞稳期、提密度，但无法阻ATP酶水解、不降pH_i至6.8、不改乙醇偏向，故生长仅部分恢复。FocAT91A积甲酸、pH_i6.8、生长略优于WT，证平衡甲酸是混合酸发酵最优态。甲酸失衡通过PflB-FocA-FHL-1轴连锁破坏CO₂/HCO₃^-供给、pH_i、ATP、膜脂合成（ACC受抑）及发酵重编程；胞内甲酸、CO₂/HCO₃^-可能是经由碳酸酐酶、ACC及F₁F_o-ATP酶感知的核心信号。该研究阐明甲酸稳态是衔接碳流分配、氧化还原平衡与能荷守衡的枢纽，对理解厌氧发酵生理边界具普遍意义。