IL-21R阻断可减少LDL受体缺陷小鼠的炎症与动脉粥样硬化

《Atherosclerosis》：IL-21R blockade reduces inflammation and atherosclerosis in LDL receptor deficient mice

　　

背景：白细胞介素-21（IL-21）是一种促炎细胞因子，参与固有免疫和适应性免疫应答的调控，并与动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）相关。然而，IL-21/IL-21R信号通路在动脉粥样硬化中的确切作用以及靶向该轴的治疗潜力尚不清楚。方法与结果：对人颈动脉斑块的单细胞RNA测序（scRNAseq）分析显示，IL-21R在调节性T细胞（Tregs）上高表达，且女性较男性、纤维性斑块较其他表型斑块中的表达水平更高。与上述发现一致，研究人员证实在年轻（20周龄）Ldlr^-/-小鼠中使用抗IL-21R单克隆抗体阻断IL-21R可增加次级淋巴器官（SLOs）中Treg频率，并伴随血清IL-10水平升高。此外，研究人员观察到经抗IL-21R治疗的小鼠主动脉和脾脏中促炎性单核细胞减少。IL-21R阻断使动脉粥样硬化斑块面积减少38%（p<0.05），巨噬细胞含量减少61%（p=0.053）。进一步对雌性Ldlr^-/-小鼠脾脏和主动脉的scRNAseq分析显示，Tregs和滤泡辅助性T细胞（Tfh）中Il21/Il21r表达呈年龄相关性增加。随后在具有明确斑块的老年（88周龄）Ldlr^-/-小鼠中进行IL-21R阻断，结果显示炎症减轻，表现为主动脉Tregs增加、SLOs中Tregs的Foxp3表达升高以及促炎性单核细胞减少。此外，经抗IL-21R治疗的老年小鼠Tfh细胞以及浆母细胞和浆细胞均减少。结论：综上，研究人员证明IL-21R阻断可减轻斑块起始、促进动脉粥样硬化保护性Tregs、抑制促炎性单核细胞并损害衰老过程中的Tfh-B细胞动态变化，代表了对抗ASCVD的一种有前景的新型治疗策略。

**论文解读：靶向IL-21R信号轴调控动脉粥样硬化免疫平衡的机制研究**

**一、研究背景与科学问题**

心血管疾病（CVD）是全球范围内的首要死因，其核心病理基础是动脉粥样硬化。该过程始于载脂蛋白B包含脂蛋白（主要是低密度脂蛋白，LDL）在动脉壁内膜下的滞留，随后脂蛋白的聚集和氧化形成氧化型LDL（oxLDL）等促炎脂质，激活内皮细胞，促进白细胞募集及持续的细胞因子驱动的免疫应答，最终导致斑块形成与进展。斑块破裂可引发心肌梗死或卒中等急性心血管事件。虽然目前以降脂为主的策略可降低CVD风险，但越来越多的证据表明免疫系统是疾病进展的核心决定因素。IL-1β、IL-6、TNFα等多种促炎细胞因子在动脉粥样硬化微环境中升高，抑制这些细胞因子对疾病结局具有有益影响，CANTOS试验即为例证——通过卡纳基努单抗抑制IL-1β可减少复发性心血管事件。白细胞介素-21（IL-21）/IL-21受体（IL-21R）轴作为适应性免疫的强效调节因子受到关注。IL-21是IL-2家族的多效细胞因子，主要由滤泡辅助性T细胞（Tfh）、Th17细胞和NKT细胞产生，通过IL-21R-γc异二聚体复合物传导信号。该信号轴促进多种T细胞亚群的分化、增殖与存活，并对B细胞淋巴瘤6（Bcl-6）表达、生发中心形成及抗体分泌细胞（ASCs）生成至关重要。然而，IL-21/IL-21R信号在动脉粥样硬化中的确切作用及其作为治疗靶点的潜力此前尚不明确。本研究旨在通过单细胞转录组学描绘IL-21/IL-21R在动脉粥样硬化斑块中的表达格局，并在年轻与老年Ldlr^-/-小鼠中评估IL-21R阻断对炎症和动脉粥样硬化的影响。

**二、主要技术方法**

研究人员利用公共及自有的人类颈动脉斑块scRNAseq数据集（来源于46例接受颈动脉内膜剥脱术（CEA）的患者，属Athero-Express生物样本库研究），分析IL21/IL21R表达谱。动物实验采用雌性低密度脂蛋白受体缺陷（Ldlr^-/-）小鼠模型：年轻小鼠（8-12周龄）喂饲西方型饮食（WTD）5周以诱导早期斑块形成；老年小鼠（77-82周龄）维持标准饮食以模拟渐进性斑块发展。两组均腹腔注射抗IL-21R单克隆抗体或同型对照，每周三次，持续5周。研究综合运用单细胞RNA测序（scRNAseq）分析小鼠主动脉和脾脏CD45⁺细胞、流式细胞术检测免疫细胞亚群、油红O染色评估主动脉根部斑块面积、MOMA-2免疫组化检测巨噬细胞含量、Masson三色染色评估胶原沉积，以及LEGENDplex多因子检测法分析血清及脾细胞培养上清中的细胞因子水平。

**三、研究结果**

**3.1 IL21R表达富集于人类颈动脉粥样硬化斑块的FOXP3⁺ Tregs**

对人类颈动脉斑块scRNAseq数据集的分析鉴定出20个转录上不同的细胞群体。IL21R转录本在所有细胞簇中均可检测到，但在T细胞簇中显著升高，其中FOXP3⁺调节性T细胞（Tregs）的表达较其他CD4⁺ T细胞最为突出。分层分析显示，女性斑块来源的Tregs中IL21R表达高于男性；纤维性斑块中FOXP3⁺ Tregs的IL21R表达高于粥样斑块或纤维粥样斑块。这些数据确立了Tregs是人类动脉粥样硬化环境中主要的IL21R表达群体。

**3.2 IL-21R阻断减少年轻Ldlr^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成并促进动脉粥样硬化保护性Tregs**

年轻雌性Ldlr^-/-小鼠经5周IL-21R阻断治疗后，体重和血清总胆固醇水平未受影响，脾脏中IL-21R⁺细胞比例显著降低（0.99% vs 12.9%，p<0.0001），证实抗体有效靶向IL-21R。IL-21R阻断使主动脉根部三瓣膜区斑块面积减少38%（0.72×10⁵ μm² vs 1.15×10⁵ μm²，p<0.05），斑块巨噬细胞含量减少61%（p=0.053）。局部和系统性髓系细胞（尤其是Ly6C^hi单核细胞）减少。同时，脾脏和纵隔淋巴结（HLN）中Foxp3⁺ Tregs频率显著增加，脾脏CD4⁺ T细胞总数亦增加。IL-21R阻断后血清中多种细胞因子（IFNγ、IL-4、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17、IL-22）显著升高，其中抗炎细胞因子IL-10升幅最大（17.8倍）且浓度最高。离体再刺激的脾细胞也显示IL-10产生增加，并与脾脏Treg数量相关。

**3.3 衰老增强小鼠主动脉和脾脏T细胞区室中Il21和Il21r的表达**

鉴于ASCVD本质上是衰老相关疾病，研究人员对老年Ldlr^-/-小鼠的IL-21/IL-21R通路进行分析。主动脉scRNAseq数据显示，老年小鼠主动脉Foxp3⁺ Tregs中Il21r表达较其他CD4⁺ T细胞显著升高，且Foxp3⁺ Tregs中Il21转录本呈年龄相关性增加。脾脏scRNAseq分析显示，Foxp3⁺ Tregs和Cxcr5⁺ Bcl6⁺ Tfh细胞是Il21和Il21r的主要表达亚群，且两者均表现出年龄相关的Il21r上调，Tfh细胞簇还呈现年龄相关的Il21表达增加。

**3.4 IL-21R阻断增加老年Ldlr^-/-小鼠的Tregs**

对具有明确斑块的老年Ldlr^-/-小鼠进行5周IL-21R阻断后，斑块大小和组成未发生改变。但IL-21R阻断显著降低了脾脏中Ly6C^hi单核细胞频率，显著增加了主动脉CD4⁺ T细胞区室中Foxp3⁺ Tregs的比例（12.95% vs 8.84%，p<0.05），并提高主动脉Tregs中增殖标志物Ki67的平均荧光强度（MFI）。此外，脾脏和HLN中Tregs的Foxp3 MFI均显著升高，表明Tregs的抑制功能增强。

**3.5 IL-21R阻断减弱老年Ldlr^-/-小鼠促动脉粥样硬化的Tfh-B细胞轴**

鉴于IL-21/IL-21R信号在Tfh-B细胞通讯中的重要性，研究人员检测了老年小鼠SLOs中的Tfh-B细胞轴。IL-21R阻断后，脾脏和HLN中Foxp3^- CXCR5⁺ Bcl-6⁺ Tfh细胞频率显著降低，而Foxp3⁺ CXCR5⁺ Bcl-6⁺滤泡调节性T细胞（Tfr）水平未受影响，导致Tfh/Tfr比值向更动脉粥样硬化保护性方向转变。同时，脾脏和HLN中衰老相关B细胞（ABCs）内促炎性T-bet⁺比例显著降低，CD138⁺ B220⁺浆母细胞和CD138⁺ B220^-浆细胞均减少，但循环免疫球蛋白水平和病变内IgG/IgM沉积未发生显著改变。

**四、讨论与结论**

本研究通过单细胞转录组学与体内功能实验相结合的策略，系统阐明了IL-21/IL-21R信号轴在动脉粥样硬化中的免疫调节作用。人类斑块数据确立了Tregs作为IL-21R的主要表达群体，且表达水平受性别和斑块表型影响，提示IL-21/IL-21R信号具有临床相关性。衰老加剧了主动脉和脾脏Tregs及Tfh细胞中Il21/Il21r的表达，表明该信号轴在晚期疾病中被强化。IL-21R阻断通过促进动脉粥样硬化保护性Tregs、抑制促炎性单核细胞和髓系细胞，以及在老年小鼠中抑制Tfh-B细胞轴和抗体分泌细胞生成，从而在斑块起始阶段发挥保护作用。虽然老年小鼠的斑块大小未在短期（5周）治疗内发生改变，但免疫调节效应已在多个层面显现，提示更长的治疗周期或更早干预可能将免疫改变转化为斑块表型的改善。既往研究已表明Tregs与斑块稳定性正相关，IL-10也与斑块稳定性和坏死核心减少相关。结合抗IL-21单克隆抗体在临床试验中已展现可接受的安全性和耐受性，本研究的结论是：IL-21R阻断可减轻斑块起始、促进动脉粥样硬化保护性Tregs、抑制促炎性单核细胞并损害衰老过程中的Tfh-B细胞动态变化，将IL-21/IL-21R信号确立为动脉粥样硬化中固有免疫和适应性免疫的重要调节因子，代表了对抗ASCVD的一种有前景的新型治疗策略，同时提示需监测长期治疗对体液免疫的影响。