《Animals》：Integrated Metagenomic and Untargeted Metabolomic Analyses Characterize Enramycin-Associated Colonic Microbial and Metabolic Changes in Weaned Rabbits
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摘要：恩拉霉素（Enramycin）被用作幼龄动物的饲用抗菌药物，但其对家兔结肠生态的影响尚未得到充分表征。本研究评估了恩拉霉素对60只断奶兔的影响，将实验动物随机分为对照组和恩拉霉素处理组（60 mg/kg），处理周期为14天（每组n = 30）。研究人员对
摘要：恩拉霉素（Enramycin）被用作幼龄动物的饲用抗菌药物，但其对家兔结肠生态的影响尚未得到充分表征。本研究评估了恩拉霉素对60只断奶兔的影响，将实验动物随机分为对照组和恩拉霉素处理组（60 mg/kg），处理周期为14天（每组n = 30）。研究人员对所有家兔进行了临床结局评估，同时每组随机选取6只无腹泻记录且存活的个体，对其配对的结肠样本进行多组学分析。恩拉霉素降低了腹泻发生率，但未影响体重发育、器官指数或死亡率。宏基因组分析显示，α多样性无显著变化，但微生物群落结构发生显著改变，包括疣微菌门（Verrucomicrobiota）、阿克曼氏菌属（Akkermansia）和另枝菌属（Alistipes）丰度降低，以及蓝藻门（Cyanobacteria）和Avigastranaerophilus属丰度升高。非靶向代谢组学共鉴定出332个符合预设筛选标准的特征代谢物，其中143个上调、189个下调。主要的通路注释包括苯丙烷生物合成和花生四烯酸代谢。耐药组分析表明，处理引起了链丝菌素类、氨基糖苷类和糖肽类相关耐药特征的转变。整合分析发现4个差异菌属与前30个差异代谢物之间存在关联。总体而言，饲粮添加恩拉霉素与腹泻发生率的短期降低以及结肠微生物、代谢和耐药基因特征的并发性改变相关。这些发现将恩拉霉素的评估扩展至传统临床结局之外，并强调了在评估断奶兔饲用抗菌药物暴露时考虑更广泛生态效应的重要性。
**基于多组学整合策略解析恩拉霉素对断奶兔结肠微生态的影响**
**研究背景与科学问题**
断奶期消化系统疾病是肉兔生产中的重大挑战。此阶段家兔消化功能和肠道微生物群落仍处于发育完善过程中，使其对日粮、环境及药理学干扰高度敏感。饲用抗菌药物被广泛用于缓解幼龄动物的肠道健康问题，然而其效应不应仅以腹泻发生率或体重变化进行单一维度评估。抗菌药物暴露还可能改变肠道微生物群落组成、代谢活性及耐药基因在肠道生态系统中的分布。因此，亟需一种将健康相关结局与肠道生态响应相联系的综合性评估框架。
恩拉霉素（Enramycin）是由杀真菌链霉菌（*Streptomyces fungicidicus*）产生的多肽类抗生素，主要通过抑制肽聚糖合成而作用于革兰氏阳性菌，且肠道吸收极少。该药物已在仔猪、肉鸡和家兔中被探索作为饲用抗菌药物。然而，既往家兔研究主要聚焦于生产性能、养分利用和腹泻结局，短期的恩拉霉素暴露是否伴随结肠微生物群落、代谢环境及耐药基因谱的变化，尚未得到充分表征。鉴于恩拉霉素有限的肠道吸收特性，其局部生态效应可能无法由常规健康和体重指标充分反映。宏基因组学与非靶向代谢组学为表征抗菌药物暴露下的肠道生态响应提供了互补性技术手段，二者的整合可系统性地揭示微生物与代谢层面的并发变化。
基于此，研究人员提出假设：短期饲粮添加恩拉霉素可在降低腹泻相关结局的同时改变结肠生态系统的特定特征。为验证该假设，研究整合了临床和体重测量与结肠宏基因组、非靶向代谢组及耐药组分析，旨在表征恩拉霉素相关的微生物、代谢和耐药基因变化，并探讨差异菌属与差异代谢物之间的关联。
**研究方法与技术路线**
本研究经西南民族大学学术伦理委员会批准（批准号：SMU-202309004），选用来自四川省畜牧科学研究院肉兔研究基地的蜀兴1号肉兔。60只35日龄健康断奶兔按体重相近且雌雄各半的原则随机分为对照组（CN）和恩拉霉素处理组（AN），每组30只，单笼饲养。AN组在基础日粮中添加0.75 g/kg恩拉霉素预混剂（8%有效含量），最终日粮浓度为60 mg/kg，试验期14天。临床结局在全部实验动物中评估，而配对结肠多组学分析选取每组6只（3雄3雌）随机选择的、无腹泻记录的存活个体进行。主要技术方法包括：基于CTAB法的结肠内容物总DNA提取、Illumina PE150双端测序及MEGAHIT组装；利用MetaProdigal进行基因预测并经CD-HIT构建非冗余基因集；采用diamond比对NR数据库进行物种注释；基于SARG v2.3数据库注释抗生素耐药基因；超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用进行非靶向代谢组学分析，Compound Discoverer 3.1处理质谱数据并经mzCloud和mzVault谱库匹配进行代谢物注释；Mantel检验和Pearson相关分析开展微生物-代谢物整合关联分析。
**研究结果**
**一、恩拉霉素对体重发育、腹泻发生率及器官指数的影响**
在完整试验群体中，CN组和AN组的腹泻发生率分别为26.67%（8/30）和6.67%（2/30），组间差异具有统计学意义（p = 0.038）。死亡率在两组间无显著差异。终末抽样亚组（每组6只）中，初始体重、终末体重、器官重量及器官指数均无组间差异。这表明短期恩拉霉素补充显著降低了腹泻发生率，但未改善体重发育。
**二、恩拉霉素对结肠微生物群落结构与功能的影响**
在物种多样性层面，辛普森指数（Simpson index）在属、KEGG条目及物种水平均无显著组间差异。然而，基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA分析显示基因丰度谱存在显著组间差异（p = 0.024），PCoA可视化进一步支持两组微生物群落结构的分离，而PERMDISP检验确认该差异并非由多元离散度所导致。
在物种组成层面，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为两组中的优势菌门。与CN组相比，AN组蓝藻门（Cyanobacteria）相对丰度显著升高，而疣微菌门（Verrucomicrobiota）显著降低。属水平上，阿克曼氏菌属（Akkermansia）、另枝菌属（Alistipes）及拟杆菌目CAG-873属显著降低，而Avigastranaerophilus属显著富集。
在功能注释层面，KEGG功能注释显示微生物基因集主要集中于核心代谢功能，其中代谢通路、次级代谢产物生物合成和抗生素生物合成等类别占比最高。耐药基因分析检测到5个耐药基因亚型存在显著组间差异：SAT-4、ANT(6)-Ia和APH(2)-IIa相对丰度升高，而vanSD和vanD降低。在耐药机制层面，链丝菌素耐药相关特征显著升高，而氯霉素耐药相关特征显著降低。
**三、恩拉霉素对结肠代谢组的影响**
PCA和OPLS-DA分析均显示AN组和CN组的代谢谱存在显著分离，模型具有良好的拟合度和预测能力（R2Y = 0.947，Q2 = 0.836）。共筛选出332个差异代谢特征，其中143个上调、189个下调。推定注释显示，6,7-二羟基香豆素、视黄酸、吲哚-3-甲酸和5-甲氧基吲哚-3-甲醛等丰度升高，而组氨酸、烟酰胺N-氧化物和MGDG O-18:4_2:0等丰度降低。KEGG通路富集分析显示苯丙烷生物合成和花生四烯酸代谢为显著富集的通路，但均未通过FDR校正。
**四、微生物-代谢物整合关联分析**
将4个差异菌属（*Akkermansia*、*Alistipes*、*Avigastranaerophilus*和CAG-873）与前30个差异代谢物进行整合关联分析。Mantel检验结果表明，*Akkermansia*和*Alistipes*主要与视黄酸、6,7-二羟基香豆素、5-甲氧基吲哚-3-甲醛及吲哚-3-甲酸相关，而*Avigastranaerophilus*与多个脂质和有机酸相关代谢物关联。代谢物间的相关热图进一步揭示了正负共变模式。
**讨论与结论**
本研究表明，恩拉霉素在降低断奶兔短期腹泻发生率的同时，并未改善体重发育和器官指数，但伴随结肠微生物群落结构、代谢特征及耐药基因谱的选择性重塑。微生物群落表现为选择性重组而非广谱耗竭，耐药基因在不同类别间呈现方向性变化而非普遍性升高。然而，由于多组学分析仅基于有限的、无腹泻记录的存活个体亚群，这些生态变化不应被解释为腹泻率降低的直接机制。该研究将恩拉霉素评估从传统临床结局拓展至更广泛的肠道生态视角，为后续剂量-反应、停药期及替代干预策略研究提供了生态学依据。研究人员在结论中指出，鉴于组学样本量有限以及缺乏盲肠、停药期和功能验证数据，这些模式的持续性和生物学意义仍需更大规模的纵向研究加以确认。
