红外热成像与血液和粪便皮质醇测量用于兔采血期间应激评估

《Animals》：Infrared Thermal Imaging and Blood and Faecal Cortisol Measurements for Stress Assessment in Rabbits During Blood Sampling

　　

摘要
背景：本研究采用红外热成像、血清皮质醇和粪便皮质醇代谢物（FCMs）评估实验室兔在反复抓取和采血过程中的生理应激反应，并评估同一房间内未接受抓取操作的兔是否也出现可测量的变化。方法：将16只健康成年兔随机分配至实验组（n = 8）和未抓取对照组（n = 8）。实验组兔在5小时内完成9次采血，作为一项药代动力学研究的一部分，每次采血前使用红外热成像测量眼周表面温度。对照组兔在相同时间点仅接受热成像测量，不进行抓取或采血。实验组兔测定血清皮质醇，两组兔均分析粪便皮质醇代谢物。结果：首次采血后，实验组兔眼周温度升高1.0 °C，对照组兔升高1.3 °C。实验组血清皮质醇在30分钟时从13.6 ± 5.5 ng/mL升高至23.7 ± 7.3 ng/mL，最终采样时降至8.1 ± 2.1 ng/mL。两组兔的粪便皮质醇代谢物均在首次采血后约9小时升高，实验组兔的升高水平持续至多三天。结论：反复抓取和采血可引发可测量的生理反应。对照组的变化表明，与操作相关的环境线索也可能影响附近未接受抓取的兔。

论文解读：基于红外热成像与粪便皮质醇代谢物的兔采血应激评估研究

研究背景与意义

实验兔是生物医学研究中广泛使用的模式动物，其生理学特性已被充分研究，并可用于多种人类疾病模型和药物评价。然而，实验过程中的抓取、固定和采血等常规操作可能诱发动物的应激反应，不仅影响动物福利，还可能干扰实验数据的准确性和可重复性。既往研究表明，应激可改变兔的心率、行为和内分泌参数，如皮质酮和催乳素水平。此外，饲养环境本身也可能影响动物行为，刻板行为的发生与兔的应激和福利水平下降密切相关。目前用于兔应激评估的方法包括检测唾液、毛发、粪便或血液中的应激相关激素，但唾液和血液采样本身即可诱导应激，从而影响所测参数。尽管早期习惯化可降低采样时的应激反应，但某些实验干预相关的疼痛或有创操作仍可能引起持续或长期的应激效应。根据3R原则，减少实验动物痛苦并改进饲养管理是动物实验伦理的基本要求，因此需要发展非侵入性的应激评估手段。红外热成像技术可在无物理接触的情况下测量体表温度，其原理是急性应激激活交感神经系统和下丘脑–垂体–肾上腺（HPA）轴，引起外周血管收缩或舒张，导致皮肤血流改变和可测量的温度变化。这种温度变化在血管丰富、毛发稀少的区域如眼周、鼻部和耳廓尤为明显。然而，目前红外热成像用于兔急性应激检测的证据有限，且缺乏其与粪便皮质醇代谢物（FCMs）等内分泌标志物关系的系统研究。因此，本研究旨在评估红外热成像能否检测实验室兔在两种不同性质和强度的常见实验应激源（采血与同室非抓取对照）下的急性应激反应，并比较其与传统激素生物标志物的一致性。

研究方法概述

研究人员选取16只8月龄新西兰白兔（品系052），雌雄各半，体重中位数3.24 kg，单笼饲养于同一实验室内。实验兔购自认可的实验动物供应商（Anlab，捷克布拉格）。经过三周适应期和每日15分钟的温和抓取习惯化后，随机分为实验组（n = 8）和同室非抓取对照组（n = 8）。实验组兔在5小时内接受9次采血（每次3 mL，自中央耳动脉采集），每次采血前使用Testo 890-2红外热像仪测量眼内侧眼角表面温度；对照组兔在相同时间点仅测量温度，不进行抓取和采血。血清皮质醇仅从实验组采集，粪便样本在两组中均按预设时间点收集，持续至采血后96小时。血清和粪便皮质醇及FCMs使用DetectX?皮质醇酶免疫分析试剂盒测定。统计分析采用重复测量广义线性模型（GLM）、Wilcoxon符号秩检验和Mann–Whitney U检验。

主要研究结果

3.1 基于温度数据的应激反应评估

两组兔基线眼周表面温度均为36.6 °C（实验组SD = 0.3 °C，对照组SD = 0.4 °C）。首次采血后，实验组眼周温度显著升高1.0 °C，对照组显著升高1.3 °C（Wilcoxon符号秩检验，实验组z = 2.060，对照组z = 2.383），组间差异为?0.26 °C（95% CI：?0.86至0.33 °C）。除首次测量外，实验组在其他时间点的眼周温度均略高于对照组，但差异未达到统计学显著水平（GLM，χ2 = 2.798，p = 0.09）。两组眼周温度均受采血时间序列的显著影响（GLM，χ2 = 20.194，p = 0.0005）。

3.2 血清皮质醇水平

在反复抓取和采血后，实验组血清皮质醇初始升高，首次采血后30分钟时显著高于基线（p < 0.05），随后逐渐下降，至240分钟时恢复至基线水平。值得注意的是，270分钟和300分钟时的皮质醇水平显著低于基线（Wilcoxon符号秩检验：270分钟z = 2.521，p = 0.012；300分钟z = 2.100，p = 0.036）。该下降趋势可能反映应激后的恢复、HPA轴负反馈调节、昼夜节律变化或对重复固定的部分适应。

3.3 粪便皮质醇代谢物

与采血前基线值相比，实验组FCMs在采血开始后9小时显著升高，达到基线的2.4倍（Wilcoxon检验，z = 2.521，p = 0.012）。对照组FCMs也显著升高，达到基线的1.9倍（Wilcoxon符号秩检验：z = 2.197，p = 0.028）。实验组FCMs升高水平持续至采血后三天（96小时）。在第二天和第三天，FCMs浓度呈现早晨较低、下午较高的趋势（24 h与34 h比较，48 h与58 h比较）。

讨论与结论

本研究表明，反复抓取和采血可诱发实验室兔可测量的生理应激反应。眼周表面温度在采血后迅速升高，实验组升高约1.0 °C，对照组升高约1.3 °C。两组间差异虽未达到统计学显著，但对照组同样出现初始温度升高，提示与实验操作相关的环境因素而非直接抓取本身，可能影响了同室未抓取兔的生理状态。血清皮质醇在采血后30分钟达到峰值，随后下降并低于基线，可能反映应激后的恢复和HPA轴负反馈调节。FCMs在采血后9小时显著升高并持续至多三天，这种延长模式不能仅用单次皮质醇峰值的肠道转运解释，更可能反映5小时内9次采血引起的HPA轴累积或反复激活，以及兔特有的盲肠食糜循环（caecotrophy）对消化道转运时间的影响。本研究的局限性包括样本量较小、单一品种和年龄、未同时评估行为和心率等互补指标、未直接测定胃肠道转运时间，且未对多重比较进行校正。从福利角度看，红外热成像作为一种非接触式重复测量手段，有望作为兔实验中的细化工具，减少抓取相关的应激并改善纵向研究的数据质量。同时，对照兔的生理变化提示，实验操作会影响同室未接受处理的动物，因此在实验设计和饲养管理中应尽量减少环境干扰，并充分考虑控制组动物在感官暴露后的潜在应激效应。论文发表于《Animals》。