《Bioactive Materials》：Barcoded oligonucleotide system (BOLT) for targeted organ delivery
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寡核苷酸（oligos）的治疗潜力受到肝外组织递送不足的限制。体外试验往往无法准确预测体内行为，而逐一在动物中测试每种寡核苷酸候选物的通量本质上仍然很低。在此，研究人员构思了一种条形码寡核苷酸系统（BOLT），该平台能够实现小分子配体的高通量体内评价，并鉴定组
寡核苷酸（oligos）的治疗潜力受到肝外组织递送不足的限制。体外试验往往无法准确预测体内行为，而逐一在动物中测试每种寡核苷酸候选物的通量本质上仍然很低。在此，研究人员构思了一种条形码寡核苷酸系统（BOLT），该平台能够实现小分子配体的高通量体内评价，并鉴定组织特异性的寡核苷酸递送。BOLT整合了寡核苷酸条形码的理性设计、模块化偶联化学以及基于下一代测序（NGS）的定量分析，能够在单个动物体内同时评估多种化学结构多样的配体-寡核苷酸偶联物。值得注意的是，该平台适用于小鼠和非人灵长类动物（NHPs）。利用BOLT，研究人员发现了对脑、肺和肌肉等组织具有趋向性的配体。总的来说，这些结果表明BOLT平台能够加速发现用于广泛寡核苷酸疗法的组织靶向配体。
**研究背景与意义**
寡核苷酸（oligo）疗法（如反义寡核苷酸[ASO]和小干扰RNA[siRNA]）在多种疾病中展现出治疗潜力，但其疗效受限于向肝外组织递送效率不足。N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）配体的开发实现了寡核苷酸的高效肝脏递送，并已推动多种ASO和siRNA药物获批。然而，血脑屏障（BBB）等生理屏障严重限制了寡核苷酸向脑、肺、肌肉等肝外组织的分布。传统的体外试验无法准确反映体内复杂的生理环境，而逐一在动物模型中测试候选寡核苷酸偶联物通量极低。因此，开发能够在一个动物体内同时高通量评估多种化学多样配体的体内筛选平台，是推进寡核苷酸疗法发展的关键需求。
**研究内容与结论**
研究人员开发了条形码寡核苷酸系统（BOLT），该系统结合寡核苷酸条形码的理性设计、模块化偶联化学和基于下一代测序（NGS）的定量分析，可在单个小鼠或非人灵长类动物（NHP）内并行评估32种小分子配体-寡核苷酸偶联物的组织分布。研究发现条形码丰度与Cy5标记寡核苷酸的组织蓄积（每克组织注射剂量百分比，%ID/g）以及功能基因沉默效率高度相关，验证了BOLT作为高通量体内筛选平台的可靠性。该平台成功鉴定出对肝（BOLT-27）、脑（BOLT-13）、肺（BOLT-26）和肌肉（BOLT-31）具有趋向性的配体，并证实了其在跨物种筛选中的适用性。该研究发表于《Bioactive Materials》，为肝外寡核苷酸疗法的靶向配体发现提供了可规模化的临床前评价平台。
**主要技术方法**
研究人员采用模块化偶联策略，将32种含有氨基、羧基、羟基、硫醇等官能团的小分子配体通过二苯并环辛炔（DBCO）接头与含3'叠氮基、8核苷酸条形码区、通用引物位点及硫代磷酸酯（PS）键的49核苷酸寡核苷酸偶联，经PCR扩增和NGS定量条形码。随后以Cy5-寡核苷酸荧光检测（%ID/g）和实时qPCR检测Malat1基因沉默效率进行正交验证。样本队列来源：小鼠为6周龄C57BL/6J小鼠（购自The Jackson Laboratory），雌雄兼用；NHP研究纳入3只恒河猴（Macaca mulatta，2雄1雌，体重约7–14 kg），于加州大学戴维斯分校加州国家灵长类研究中心开展。
**研究结果**
**3.1 BOLT平台的构建及敏感性验证**：设计并合成了49核苷酸条形码寡核苷酸，通过GalNAc偶联验证了平台的可行性。GalNAc-寡核苷酸在1小时内大部分从血液清除；条形码读数随剂量降低而递减，且在0.001至0.5 mg/20g剂量范围内呈线性响应，表明平台具有高灵敏度和定量准确性。
**3.2 高通量体内评价组织靶向配体**：将32种BOLT偶联物混合注射小鼠，NGS分析显示不同配体的组织趋向性存在显著差异且生物学重复间可重现。BOLT-27（GalNAc）表现出强肝趋向性；BOLT-13在脑中递送效率比其他配体高3倍以上；BOLT-26和BOLT-31分别富集于肺和肌肉。
**3.3 条形码丰度与Cy5-寡核苷酸组织蓄积的相关性**：选取5种代表性BOLT偶联Cy5-寡核苷酸，发现%ID/g趋势与条形码分布高度一致，肝、肺、骨髓、脑和肌肉中Pearson相关系数r为0.80至0.91，证实条形码读数能真实反映配体依赖性递送行为。
**3.4 体内基因沉默效率评价**：将代表性BOLT偶联靶向转移相关肺腺癌转录本1（Malat1）的ASO，qPCR结果显示肝、肺、肾、骨髓、脑、肌肉和脾中基因沉默趋势与条形码分布高度一致（r为-0.6至-0.86）。BOLT-13偶联靶向微管相关蛋白tau（Mapt）的ASO在脑中实现约15%的基因沉默；游离ASO在多数组织中沉默效率显著较低。安全性评估显示20 mg/kg剂量下未引起肝脏和肾脏毒性标志物（天冬氨酸转氨酶[AST]、丙氨酸转氨酶[ALT]、γ-谷氨酰转移酶[GGT]、血尿素氮[BUN]、肌酐）明显升高，组织学未见明显病理改变。
**3.5 NHP中的跨物种验证**：将32种BOLT偶联物混合注射恒河猴，组织条形码分析显示NHP中鉴定的主要靶向配体与小鼠结果部分一致。肝、肺、肾、骨髓和肌肉中跨物种Spearman相关系数ρ为0.54至0.66；脑和脾为0.42至0.47；胰腺和心脏相关性可忽略。
**讨论与结论**
讨论部分指出，BOLT平台的库容量不受平台本身限制，而受限于可供筛选的化学配体数量；条形码定量在四个数量级内呈线性，单次实验可复用数十至数百种偶联物。平台不仅可鉴定组织特异性配体，还可识别多组织趋向性配体（如BOLT-26），为不同疾病情境下的递送策略选择提供参考。未来BOLT可与荧光激活细胞分选（FACS）结合，将分析分辨率从组织水平提升至细胞水平。结论部分总结：BOLT是一种可规模化的体内高通量评价平台，条形码丰度与组织蓄积和基因沉默活性相关，能够鉴定具有组织选择性或多器官分布特征的配体，并在小鼠和NHP中均得到验证，为肝外寡核苷酸疗法的开发提供了重要基础。
