《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics》：Effects of increases in temperature and genipin on mitochondrial function in primary fibroblast cells of dogs of different sizes and ages
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摘要在恒温动物中，与大型动物相比，小型动物的热量损失和产热需求增加，线粒体是动物体内负责产热的主要细胞器。因此，在不同体型的动物中，线粒体在对温度的敏感性和通过 ATP 解偶联产热的能力方面可能存在差异。在此，我们使用了从大型犬幼犬和老年犬、小型犬幼犬和老年犬中分离出的原代成
摘要
在恒温动物中，与大型动物相比，小型动物的热量损失和产热需求增加，线粒体是动物体内负责产热的主要细胞器。因此，在不同体型的动物中，线粒体在对温度的敏感性和通过 ATP 解偶联产热的能力方面可能存在差异。在此，我们使用了从大型犬幼犬和老年犬、小型犬幼犬和老年犬中分离出的原代成纤维细胞，以确定狗在不同体型和年龄下的线粒体功能是否相似，或者小型犬是否由于其低体温和高质量特异性代谢率的整个动物表型而倾向于更容易解偶联和更敏感于温度。我们比较了暴露在 37 和 40 °C 下细胞的代谢率，以确定热敏感性。我们发现，在 40 °C 组中，所有体型和年龄类别的基础呼吸和质子泄漏均增加，而偶联效率和备用呼吸能力降低，表明较高的温度会使狗的线粒体解偶联，但体型不影响温度敏感性。此外，为了阐明解偶联的机制差异，我们用 UCP2 抑制剂京尼平处理细胞，发现京尼平处理的细胞在小型老年犬中增加了质子泄漏，但在大型幼犬中减少了质子泄漏。对 UCP2 抑制的不同反应与先前在不同体型和年龄类别的狗中发现的代谢组学差异相关，我们的数据表明 UCP2 的作用取决于细胞的代谢表型。
引言
在整个生物体水平上，由于表面积与体积（SA:V）的差异，小型动物的产热和散热量比大型动物增加 [1]。因此，在恒温动物中，用于体温调节的能量以及相关的代谢率可能因体重而异 [2]。在细胞水平上，线粒体是动物体内负责产热的主要细胞器，并具有与产热过程相关的关键生理功能，例如支持恒温动物的体温、平衡能量消耗和摄取，以及控制活性氧（ROS）以减少对细胞器的损害 [3]、[4]。然而，与 ATP 产生相比，产热及其相关的基于细胞的过程往往是线粒体生理学研究中较不重视的一个方面。当线粒体膜间隙中的质子主要通过 ATP 合酶扩散进入线粒体基质时，ATP 产生被描述为高度偶联，因为底物氧化产生的能量中有更大比例转化为 ATP 形式的化学能。然而，当线粒体质子泄漏减少了通过 ATP 合酶的质子比例时，ATP 产生解偶联，更大比例的能量以热的形式释放 [5]。一般来说，线粒体解偶联通过降低细胞中 ATP 产生的效率来加速呼吸 [3]。
ATP 产生可能由于多种机制而变得解偶联，但关于解偶联的许多研究都集中在大多数动物细胞线粒体中发现的一组称为解偶联蛋白（UCPs）的蛋白质上 [6]。UCPs 是线粒体转运蛋白家族成员，共享相似的氨基酸序列 [7]。该转运蛋白有三种亚型；每种在线粒体中具有不同的功能。UCP2 是一种在所有哺乳组织中都普遍表达的亚型，特别引人注目，因为先前的研究表明它通过不同的机制调节线粒体稳态。解偶联假说认为 UCP2 介导线粒体质子泄漏，并通过消散线粒体质子梯度来降低 ATP 偶联效率，从而有助于产热 [8]、[9]、[10]、[11]。或者，代谢假说认为 UCP2 防止丙酮酸在 Mitochondria 中降解为乙酰辅酶 A，有效地停止 Mitochondria 对葡萄糖的氧化，而不会有助于产热 [6]、[7]。这些假说并不互斥，UCP2 可能部分作为解偶联剂，同时在葡萄糖、谷氨酰胺和脂质代谢中也发挥作用 [6]、[12]、[13]。无论其在细胞中的机制作用如何，UCP2 还可能有助于调节 ROS 形成并调节可能导致细胞损伤的细胞事件 [6]、[14]。
由于线粒体中的解偶联影响细胞内的产热，解偶联的程度可能会响应体温调节需求和细胞温度而变化。恒温动物的高热量损失率可能与线粒体内解偶联增加有关，因为需要产生更多的代谢热以维持稳态设定点 [15]、[16]、[17]、[18]、[19]。事实上，小型哺乳动物通常因较高的 SA:V 比而经历更大的热量损失，在基础代谢率下经历的解偶联比大型哺乳动物大 [15]。此外，细胞温度的变化会影响细胞内的代谢率和解偶联，并转化为整个动物的反应 [1]、[17]。这些变化中的许多可归因于较高温度下血浆和线粒体膜的流动性增加。这些流动性变化增加了细胞膜的通透性，并允许整合膜蛋白的活动水平增加，从而提高基础代谢率和解偶联 [20]（Turner et al., 2003）。然而，细胞温度对不同体型和体温调节策略动物的线粒体功能的影响尚未完全阐明。例如，从单峰驼（一种日常变温动物）中分离出的原代成纤维细胞的耗氧量，即使维持在高至 41 °C 的温度下，也未显示出耗氧速率的变化。另一方面，南部白犀牛（一种体型较大的稳定恒温动物）具有更敏感于温度的线粒体，并在高温下耗氧速率受到抑制 [21]。这项研究进一步证明，整个动物水平的温度敏感性会延伸到细胞水平，并可以在原代成纤维细胞培养中测量。
家犬的体型相差 44 倍，从 2 公斤的吉娃娃到 90 公斤的大丹犬，是确定体重和代谢如何在从整个动物到细胞水平的组织水平上协同进化的理想模型 [22]、[23]。在整个生物体水平上，家犬表现出体重与质量特异性基础代谢率之间的负相关 [22]。此外，家犬的体温与体重呈正相关。综合来看，我们可以假设小型犬经历的热量损失比大型犬大，这解释了它们较低的体温。我们随后可以假设小型犬将其代谢率的更多部分分配给产热，从而增加其质量特异性代谢率 [24]。在细胞水平上，关于这种整个动物表型的机制后果知之甚少，或者不同体重的狗中分离出的线粒体是否具有不同的热敏感性。然而，我们可能预期小型犬的线粒体具有更多解偶联的 ATP 产生和更多的 UCPs，与大型犬相比，以便在寒冷暴露期间为增加的能量需求做好准备 [18]（Speakman, 2005）。
在此，我们使用了从大型犬和小型犬中分离出的原代成纤维细胞，以确定不同体型的线粒体功能是否相似，或者小型犬是否由于其整个动物表型而倾向于更容易解偶联。在每个体型类别内，我们包括了从幼犬和老年犬中分离出的成纤维细胞，因为老年犬在代谢表型上与幼犬不同，包括更多解偶联的 ATP 产生以及使用不同的代谢途径和氧化底物 [25]（Brookes and Jimenez, 2021）。因此，与幼犬相比，老年犬可能对细胞环境变化做出不同的反应。在所有细胞中，我们提高外部温度以加速 ATP 消耗和产生，以确定狗在不同体重和年龄下的热敏感性。此外，我们用 UCP2 抑制剂京尼平处理细胞以抑制细胞内的 UCP2 功能 [26]，并量化该蛋白对相同细胞中线粒体功能的作用。探索 UCP2 活动及其与线粒体功能和细胞代谢的关系是新颖的，可能提供一种强大的新机制来理解该蛋白在体重和代谢表型变化时的确切功能。
章节片段
材料与方法
原代成纤维细胞已被确立为许多动物的有用模型系统，因为它们易于在组织培养中使用且在体内丰富 [27]。先前的工作表明，从狗中分离出的原代成纤维细胞保留了品种特异性代谢特征 [16]、[25]、[28]，以及对某些治疗的反应 [29]、[30]、[31]、[32]。
结果
先前发表的研究描述了与体型类别和年龄类别相关的差异，类似于我们在本研究中观察到的模式。例如，在本研究中，我们发现老年犬的基础呼吸、ATP 产生和偶联效率显著高于幼犬（分别为表 S7、S22 和 S27），与之前的发现 [25]、[31]、[32] 相似。在本研究中，我们还发现老年犬具有显著更高的备用呼吸
讨论
我们让从小型犬和大型犬的幼犬和老年犬中分离出的原代成纤维细胞应对温度升高以及 UCP2 抑制剂京尼平处理。我们一致发现，将温度从 37 升高到 40 °C 增加了基础代谢率和质子泄漏，同时降低了备用呼吸能力和偶联效率。然而，京尼平的效果取决于狗的年龄和体型类别，尽管我们的结果主要复制了之前的发现
CRediT 作者贡献声明
Ana Gabriela Jiménez：撰写 – 初稿，验证，资源，方法论，调查，资金获取，数据整理，构思。 Max Warriner：撰写 – 审阅与编辑，可视化，正式分析。 Danny Molyneux：撰写 – 审阅与编辑，正式分析。 William Cipolli：撰写 – 审阅与编辑，可视化，验证，监督，正式分析。 Alex M. Champagne：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，验证，方法论，
伦理批准
本研究中所有程序均获科尔盖特大学机构护理和使用委员会批准，协议编号为 1819-13。
关于生成式人工智能及写作过程中人工智能辅助技术的声明
本手稿的任何部分均未使用人工智能撰写。
资助
Seahorse XFe96 氧通量分析仪是通过 国家科学基金会 大型研究仪器资助（NSF MRI 1725841 授予 AGJ）购买的。科尔盖特大学授予 AGJ 的 Picker 资助资助了这项工作。
未引用的参考文献
[68]、[69]、[70]、[71]、[72]、[73]、[74]、[75]、[76]
致谢
我们感谢以下繁育者提供他们幼犬的组织：David Jones、Nelda Herman、Tina Moore、Kristina Thorson、Jenny Marti、Susie Griffin、Mary J. McKennan、Heather Stimson、Lee Mustion、Meredith Hayes、Cindy Cross、Jennifer Boyd、Terry Chaloupecky、Joanne Manning、Shelly Wing 和 Lisa Waldron。我们也感谢 Kerri Hudson、Frank Capella、Jim Bader、Valeria Rickard 和 Brian Minor 博士在收集组织方面提供的帮助。科尔盖特大学的 Picker 资助
Ana Gabriela Jiménez|Max Warriner|Danny Molyneux|William Cipolli|Alex M. Champagne
美国纽约州汉密尔顿，科尔盖特大学生物系，邮编 13346
