《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Mass photometry and its expanding role in membrane protein research: The
Torpedo marmorata nicotinic acetylcholine receptor as case study
•研究人员展示了质光光度法（mass photometry, MP）方法在膜蛋白表征中的应用及其与结构研究的整合。•质光光度法能够在不同膜模拟系统中对膜蛋白寡聚体种类进行快速定量表征。•质光光度法可以补充并整合质谱（mass spectrometry, MS）和结构生物学工作流程，例如天然质谱（native MS）和冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM），用于复杂样品的实验评估。
**1. 引言**
整合膜蛋白（integral membrane proteins, IMPs）参与关键生物学过程，从细胞间信号传导、蛋白质转运到能量产生。尽管占当前药物靶标的60%以上，但它们既是关键又具挑战性的生物靶标。在结构研究范畴内，其跨膜结构域的疏水性导致其与大多数基于溶液生物物理和结构技术不兼容。它们需要模拟脂质环境的增溶/稳定环境，这可能难以处理，因为它们使分析和数据解释复杂化。另一个关键挑战是用于IMP结构研究的可获取材料稀缺。当需要优化某些方法时，这可能是限制因素，并可能使需要高浓度或高均质样品的技术实施变得不可能。
质光光度法（MP）是一种无标记、单分子技术，通过检测单个颗粒不可逆结合到玻璃-水界面时散射光的变化来测量溶液中生物分子的质量。其原理基于干涉散射显微镜：当分子着陆在表面时，其散射光与界面反射光发生干涉，产生对比度信号，该信号在宽范围内与颗粒的分子质量成正比。MP测量通过将稀释样品（通常在低纳摩尔范围）沉积到玻璃盖玻片上并记录结合事件的时间序列来进行。每个结合事件产生一个对比度值，使用由已知质量的标样建立的校准曲线转换为质量。得到的质量分布提供物种的相对丰度、寡聚状态和样品异质性，在最佳条件下可达到约2%的质量精度和20 kDa的分辨率。不确定性主要由校准质量、光子噪声和表面相互作用主导，而非整体平均。MP可实现不同的采集模式。样品表征最常用的方法是着陆测定法，仪器记录单个大分子在玻璃表面的光散射干涉图案。另一种采集模式称为动态质光光度法，可记录单个颗粒在玻璃表面扩散的过程。通过沿轨迹追踪颗粒，可跟踪对比度图案的变化，从而评估与复合物形成/解离相关的质量变化。从MP测量和极少量的起始材料中，可以直接推断化学计量、寡聚平衡、组装途径以及辅因子或配体的结合，适用于包括可溶性蛋白质、核酸、生物制药甚至IMP在内的广泛生物分子。
常用于表征IMP制品的经典生物物理技术包括：i) SDS-PAGE和Western blotting用于评估纯度、均质性和同一性；ii) 尺寸排阻色谱（SEC）和SEC-多角度光散射（SEC-MALS）用于评估寡聚状态、分子质量和聚集；iii) 圆二色光谱（CD）和红外光谱用于探测二级结构；iv) 动态光散射（DLS）和分析超速离心（AUC）用于估计尺寸分布和异质性；v) 功能测定如配体结合或活性测量以确认蛋白质功能性和生物活性。一级结构可使用质谱（MS）技术评估，如肽作图验证氨基酸序列和翻译后修饰（PTMs）鉴定。天然质谱（native MS）也可用于评估这些信息以及探测生物样品的寡聚状态。尽管有这些广泛的工具，但使用这些成熟的方法表征IMP仍然具有挑战性。这种困难源于其低表达产量、在天然脂质双层外的固有不稳定、对去污剂的敏感性，以及多种寡聚状态、聚集体或部分展开物种的频繁共存。这些局限性强调了在进行功能或结构研究（如cryo-EM、晶体学或NMR）之前仔细表征IMP制品的必要性，因为微妙的异质性可能损害生化解释或阻碍高分辨率结构测定。
对于IMP的研究，MP作为单分子方法尤其具有影响力，因为它能够直接在广泛的膜模拟环境中测定天然寡聚状态。由于IMP和膜模拟物都可能显著异质，MP能够对IMP颗粒进行全面质量测量。MP已成为一种易于实施且用户可及的质量控制技术，可直接在溶液中以及在不同膜模拟环境中快速、无标记地测定IMP的质量分布，如去污剂、替代表面活性剂如两亲性聚合物（两亲多聚物和苯乙烯-马来酸酐共聚物）、蛋白质纳米盘、Salipro纳米颗粒甚至肽盘。通过使用模拟膜环境的特殊涂层，还可以研究IMP的寡聚化过程以及膜模拟物对其的影响。
在此，研究人员以电鳐（*Torpedo marmorata*, Tm）烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）为案例研究，展示了MP在IMP分析中的应用示例。nAChR是配体门控离子通道，介导神经系统中快速突触传递。这些受体主要存在于神经肌肉接头处的突触后膜（触发肌肉收缩）以及中枢和周围神经系统（调节注意力、学习、记忆和奖赏等过程）。nAChR的功能障碍或失调与一系列疾病有关，包括尼古丁成瘾、精神分裂症、癫痫和阿尔茨海默病等神经退行性疾病，使其成为治疗药物开发的重要靶标。Tm-nAChR是结构生物学中表征最充分的配体门控离子通道之一，最初使用来自扁平管状囊泡结晶的突触后膜的螺旋重建cryo-EM图像，随后通过单颗粒分析cryo-EM。从这种海鳐电器官中大量分离，Tm-nAChR是一种肌肉型糖蛋白受体，由四种不同亚基组成五聚体结构，化学计量为α?βγδ（~268 kDa）。在天然膜中，Tm-nAChR以二硫键交联的五聚体二聚体（十聚体）形式存在，δ亚基之间有桥接。在分子水平上，受体通过两个乙酰胆碱分子在细胞外α/γ和α/δ亚基界面处的结合而激活。研究人员将在此使用Tm-nAChR作为模型系统，并利用两亲性聚合物（如环烷烃修饰的两亲多聚物（CyclAPols））的特性，在没有游离表面活性剂的缓冲液中制备IMP样品。结合文献中的其他示例，研究人员展示了MP在IMP分析中的多功能性，包括单分子群体的量化、膜生物分子组装的研究以及膜相关现象的表征。
**2. 膜蛋白的质光光度法：获得最佳质量数据和一致分析的建议与技巧**
MP应用于IMP比可溶性蛋白质更具挑战性，因为膜模拟物会显著影响数据质量，且IMP在典型MP实验条件下不太可能保持稳定。虽然深入优化一系列实验参数对获得最佳数据质量很重要，但研究人员已确定了几个与IMP分析相关的关键因素。
•缓冲液优化：为获得高质量MP图谱，应尽可能最小化背景噪声。Kratochvil等人建议在蛋白质添加前记录纯缓冲液时，负质量事件（解结合事件）应<100，以确保MP信号最佳质量。对于IMP增溶缓冲液，去污剂的存在会显著增加背景噪声。最常用的分析缓冲液倾向于产生较低范围的信号（通常<50 kDa）。当使用去污剂增溶的IMP或其他膜模拟环境时，空载体（胶束、双囊等）的存在会产生显著的背景噪声。对于落入较低质量范围的IMP，获得高质量MP信号可能具有挑战性，因为其信号可能与去污剂胶束的信号重叠。这个问题可以通过彻底表征缓冲液和优化去污剂浓度来缓解。蛋白质/去污剂相互作用的解离速率通常低于分钟级别，因此IMP在分析期间（通常60秒）可保持稳定，即使在低于临界胶束浓度（CMC）的去污剂浓度下也是如此。高于CMC的去污剂浓度可防止IMP聚集，但会导致强烈的信号以及结合和解结合事件的拥挤。这导致MP数据质量差，因为高对比度事件与低对比度事件重叠，降低了低质量物种的可检测性。当使用达到或超过其CMC的去污剂时，液滴的表面张力和形状会改变。因此，高去污剂浓度可能使测量困难，因为液滴在采集过程中可能破裂或变平，并使一致的对比度测量更具挑战性。
•采集条件：由于MP读数以视频形式呈现，也可以在测量过程中监测样品稳定性。因此，对于最不稳定的样品，较短的采集时间可能更可取。为确保样品一致扩散到液滴中，移液技术也是一个重要因素。
•MP校准：校准是MP采集和生成高质量数据中的关键步骤。为确保最佳质量测量精度，必须选择校准混合物的质量范围以匹配分析物的预期质量。温度变化显著影响实验结果，因为干涉图案是温度依赖的。因此，需要重复和频繁校准（每隔几小时）以保持一致的质量精度。维持稳定的室温、缓冲液和样品温度对于获得可靠和可重复的数据至关重要。执行和组合重复实验有助于识别实验异常值并提高数据的代表性。
•Tm-nAChR在非还原条件下MP信号的优化示例：研究人员选择Tm-nAChR作为案例研究，以说明IMP浓度对两种不同增溶环境中MP信号质量的影响：i) 常用十二烷基麦芽糖苷（DDM）和ii) 环烷烃修饰的两亲多聚物C8-C0–50（CyclAPol）。一项比较研究表明，虽然两亲多聚物的理化性质与DDM有相似之处，但它们在浓度依赖性行为上有所不同。值得注意的是，含两亲多聚物溶液的界面性质与聚合物聚集体形成的起始无直接关联，这使其可以在没有去污剂观察到的即时表面张力变化的情况下处理。使用CyclAPols，从膜中直接增溶IMP并通过亲和层析进一步纯化可以去除过量聚合物。因此CyclAPols允许后续IMP表征在完全没有游离表面活性剂的溶液中进行。简言之，Tm-nAChR使用不同的增溶环境（DDM或CyclAPols）从电器官膜中提取，然后通过亲和层析纯化。在没有还原剂的情况下，nAChR以十聚体形式存在于天然膜中，两个五聚体的δ亚基之间有共价二硫键。图1展示了在DDM（DDM-nAChR）和CyclAPols（CyclAPols-nAChR）中纯化的Tm-nAChR获得的MP直方图。DDM-nAChR和CyclAPols-nAChR的初步表征显示两个样品都是多分散的。例如，图1C显示十聚体nAChR的主要群体（mTH~570 kDa，48%）和低丰度的五聚体nAChR次要群体（mTH~284 kDa，17%）。在不同浓度（从80到5 nM）下的表征表明，虽然这些物种在两个样品的整个浓度范围内都可以被识别，但高质量十二聚体物种在稀释至5 nM时趋向于解离。通过降低分析物浓度，能够观察到较低质量的群体，并且随着浓度降低，MP峰变得更尖锐（对于DDM-nAChR在80 nM时，十聚体的高斯半宽为80 kDa，而在5 nM时为26 kDa）。这种在较低nAChR浓度下MP数据质量的提高是因为结合事件散点图在5 nM时比80 nM时在整个视频持续时间内保持一致。更少的重叠结合事件对质量分辨率和精度产生积极影响。然而，在较低的IMP浓度（5 nM）下，检测到解结合事件和低质量群体丰度均增加，表明寡聚体去稳定化和解离。因此最佳分析物浓度是样品依赖性的，并根据IMP大小（寡聚状态）而变化，这意味着在MP分析前需要筛选样品特异性最佳条件。
**3. 质光光度法：快速质量控制IMP制备的首选技术**
MP作为一种强大的质量控制技术，可直接在溶液中以及不同膜模拟环境中快速、无标记地测定IMP的质量分布。图2展示了在不同环境中增溶的IMP的几个示例：在不同增溶环境（DDM和CyclAPols）中纯化的Tm-nAChR，以及文献中在SMA中纯化的WbaP和在Salipro纳米颗粒中增溶的mPANX1的示例。DDM和月桂基麦芽糖苷-新戊二醇（LMNG）是最常用的去污剂之一，因为它们易于处理、廉价，并且通常能够纯化大量蛋白质。然而，为了在纯化过程中更好地保留内源脂质环境（通常对于维持适当的IMP活性或寡聚化是必要的），基于聚合物或多肽的膜增溶策略旨在提供更"类天然"的膜模拟物。所得样品也可以使用MP进行评估。
MP还提供了对IMP结合的膜模拟物和PTMs质量贡献的洞察，这两者共同造成理论质量与测量质量之间的差异，如nAChR所例证。将DDM-nAChR用无DDM缓冲液广泛稀释，将最终去污剂浓度降低至CMC的10-100倍以下，促进蛋白质结合的DDM分子从跨膜表面解离。尽管有这种解离，蛋白质在短时间内仍保持可溶性，如MP直方图所示，DDM-nAChR主要群体的质量分别为293±16 kDa的均质群体。由于Tm-nAChR高度糖基化，测量质量与蛋白质氨基酸序列（267.8 kDa）和糖基化修饰（~16 kDa）相当一致，导致预期蛋白质质量为284 kDa。残留的nAChR结合DDM分子仍可解释测量中观察到的质量差异。对于CyclAPol-nAChR样品，测量到395±24 kDa的质量。与DDM样品相比，即使在广泛稀释下，两亲性聚合物仍保持与跨膜结构域结合。因此，+102 kDa的质量增量反映了nAChR结合聚合物（80至90 kDa之间）的贡献，很可能还有内源共提取脂质（估计在17至29 kDa之间）的贡献。因此，MP可以提供关于IMP的均质性和质量以及其增溶环境的信息。每个群体的质量分布宽度指示了这种均质性以及去污剂数量的差异或更复杂环境均质性（如肽盘、纳米盘、SMALP和复合膜模拟物）的差异。
MP也是一种有价值的评估批次间一致性的技术，样品消耗低，使其对常规质量控制极具吸引力。图3A展示了使用CyclAPols增溶并在50 mM β-巯基乙醇还原剂存在下获得的不同批次Tm-nAChR样品的MP直方图。不同纯化批次获得的样品显示出极好的质量一致性，主要寡聚体群体分别在398±30、385±20和396±24 kDa处测量到。MP还可以通过低质量范围信号贡献的变化来突出样品均质性，作为批次质量的指标。图3B-E展示了在来自*Gloeobacter violaceus*的约180 kDa质子门控细菌离子通道（GLIC）上进行MP批次评估的示例，该通道是人类配体门控离子通道的关键结构和功能模型。批次1是新纯化的DDM-GLIC样品，在195±13.8 kDa处表现出主要群体（>40%），对应于五聚体GLIC（WT；理论质量=182.7 kDa）。还检测到低丰度物种，对应于去污剂胶束或单体物种（33±16.8 kDa，12%），以及高质量聚集体（392±40 kDa，23%）。经过长时间储存（-80°C下10个月）后，批次1显示缓冲液/单体信号（>24%）和高质量聚集体（>29%）显著增加，同时GLIC五聚体群体减少（23%），表明样品降解。除了批次间可比性研究外，MP还能够筛选点突变对GLIC寡聚化的影响。图3D和E分别代表新鲜纯化的DDM蛋白和储存蛋白（-80°C下10个月）的H235F GLIC突变体的质量直方图。新制备样品表现出均质的五聚体质量分布（>50%，在237±43 kDa），而储存后观察到五聚体信号的完全丧失，因为大多数事件在长时间储存后表现为缓冲液/单体信号。总之，这些简单的MP实验揭示H235F突变不影响寡聚状态，因为WT和突变GLIC都显示五聚体信号作为主要物种。相反，该突变对长时间储存后五聚体的稳定性有强烈影响。
**4. 质光光度法用于优化IMP纯化工作流程**
筛选特定表面活性剂或膜模拟物的不同组合，以及优化缓冲液条件，通常需要实现高质量蛋白质纯化和制备。研究人员因此实施MP来优化δ亚基之间形成十聚体为五聚体的共价二硫键桥的还原。研究人员筛选了各种还原条件（3种不同还原剂在不同浓度下）。作为起点，分析了在纯化过程中没有还原剂的样品。如预期，样品中存在的主要寡聚体群体对应于nAChR共价十聚体（42%），次要群体为nAChR五聚体（14%）和与nAChR解离亚基（α、β、γ、δ）、聚合物聚集体和缓冲液噪声重叠的低质量群体（33%）。在亲和纯化步骤前添加1 mM TCEP后，CyclAPol-nAChR的MP图谱仍显示三个主要寡聚体群体：nAChR十聚体（719±28 kDa，37%）、nAChR五聚体（358±17 kDa，15%）和低质量群体（<150 kDa，11%）。这表明使用1 mM TCEP仅实现了nAChR十聚体向五聚体的部分还原。图4C展示了TCEP（红色）、β-巯基乙醇（黄色）和DTT（绿色）的五聚体百分比随还原剂浓度的MP定量。值得注意的是，对于这种"快速粗略"的样品纯化条件优化，只要实验在同一分析时段内进行，严格的校准不一定是必需的。有趣的是，与β-巯基乙醇和TCEP相比，DTT总是导致更高量的五聚体，在30 mM时达到平台期，检测到约63%的五聚体，表明DTT是将nAChR十聚体转化为五聚体的"最佳"还原剂，而β-巯基乙醇在更高浓度（>10 mM）下提供类似的还原效果（>50%五聚体）。在最佳还原条件下获得的MP直方图示例展示在图4D-F中，分别突出了β-巯基乙醇（10 mM，55%五聚体）、DTT（30 mM，61%五聚体）和TCEP（0.1 mM，46%五聚体）的最佳五聚体转化率。值得注意的是，在最佳还原剂浓度以上，五聚体群体的信号开始下降，低质量物种出现，与nAChR降解一致，要么通过亚基/缓冲液噪声信号量化的显著增加，要么通过信号的完全丧失。通过优化纯化工作流程的还原步骤（使用50 mM β-巯基乙醇），可以获得均质五聚体nAChR（398±47 kDa，65%）样品，残余十聚体最少（<5%），与SEC图谱一致。总之，这些结果突出表明MP特别适合监测将Tm-nAChR从十聚体转化为五聚体的还原步骤的结果。MP独特地保留了非共价五聚体组装，同时检测共价十聚体物种的解离。
**5. 质光光度法用于交叉验证和监测正交生物物理技术**
**a. MP与cryo-EM的关联**
在过去十年中，cryo-EM已成为提供IMP三维结构的重要方法，推动了高分辨率结构数量的增加。cryo-EM已被证明能够克服IMP样品固有的大多数限制，允许在更复杂的增溶环境中探测IMP结构，朝向近天然膜条件。MP可用于筛选和cryo-EM网格制备前的样品质量控制。Niebling等人提出了关于MP如何帮助IMP的cryo-EM实验的综合指南，描述了去污剂组成筛选及其与网格质量的相关性，以及MP在检查大型复合物完整性及其丰度方面的适用性。虽然负染色EM通常用于在筛选最佳cryo-EM条件期间评估样品均质性，但MP可以在无标记天然条件下提供类似信息。此外，分析时间更短，允许最佳条件筛选，因为它使用极少量的样品（
**b. MP用于交叉验证天然质谱**
天然MS是确定蛋白质和蛋白质复合物化学计量和高阶结构的关键技术。它提供高精度质量测量，并可探测IMP的PTMs和与天然脂质的相互作用。然而，IMP的天然MS既需要重要的用户专业知识，也需要专业仪器，而优化可能既耗时又耗材料。在天然MS中，蛋白质在温和的非变性条件下从溶液转移到气相，保留非共价相互作用。这通常使用挥发性、MS兼容的缓冲液如乙酸铵实现，维持近生理离子强度同时允许有效去溶剂化。因为大多数生化缓冲液和常用添加剂是非挥发性的，强烈抑制电离，缓冲液交换是天然MS前关键的准备步骤，通常被认为可能改变四级结构。没有有效的缓冲液交换，谱图会遭受加合物形成、信噪比差、质量精度降低甚至分析物信号完全丧失。可以实施不同的策略，如手动缓冲液交换或使用短脱盐SEC柱简化到MS平台。然而，缓冲液交换有一系列局限性，因为它可能耗时和消耗样品（缓冲液交换时生物材料损失），并可能扰动不稳定蛋白质或复合物，导致解离、聚集或辅因子和配体丢失。这些风险对低丰度或不稳定蛋白质尤其相关，即使温和处理也可能使观察到的物种产生偏差。因此，缓冲液交换不仅是技术必要性，而且是可能直接影响天然MS获得的结构信息的实验变量。这些考虑对于需要膜模拟物（去污剂、两亲多聚物、纳米盘等）保持可溶性的IMP更为相关，其中许多与天然MS不兼容或需要仔细优化以有效从气相释放IMP。因此，在天然MS之前，缓冲液交换和系统缓冲液筛选对于确定平衡IMP溶液中稳定性与质谱仪中有效去溶剂化和去污剂去除的条件至关重要。缓冲液组成的微小变化可能显著改变寡聚状态、配体结合或整体均质性，使MS前缓冲液效应的评估在IMP工作流程中特别有价值。此外，微旋转柱上的缓冲液交换可能导致去污剂胶束显著浓缩，这可能影响MS谱图质量。
在此背景下，MP具有作为天然MS前质量控制决策工具的强大潜力。图6展示了在Tris-HCl缓冲液中纯化并使用两种不同缓冲液交换策略进一步交换到不同含去污剂缓冲液中的DDM-nAChR的MP直方图：在线SEC脱盐和微旋转柱手动缓冲液交换。去污剂筛选可能是获得IMP高分辨率天然质谱所必需的，因为常用去污剂如DDM在电离过程中通常难以解离，而更多MS兼容的去污剂可以产生更好的分辨谱图。然而，这些去污剂可能妨碍IMP稳定性。MP显示，在含有DDM的纯化后储存缓冲液中，不同样品批次始终检测到nAChR五聚体，在针对200 mM乙酸铵/0.04 mM DDM、200 mM乙酸铵/14 mM C8E4和200 mM乙酸铵/3 mM LDAO缓冲液交换后在几分钟内保持稳定。这个简单实验明确确认缓冲液交换过程不会显著触发nAChR更高寡聚状态。虽然MP不允许评估缓冲液交换的效率，但验证寡聚体的保存有助于促进IMP的天然MS研究，节省时间和材料。
**6. 材料与方法**
**6.1. 电鳐nAChR纯化**
冷冻的*Torpedo marmorata*电器官在含有蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液（10 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、5 mM EGTA、0.02%（m/v）NaN?、0.1 mM PMSF、0.5 g·L?1 N-乙基马来酰亚胺（NEM），pH 7.4）中匀浆。溶液离心后，回收上清液并以100,000 xg离心1小时。含有粗膜的沉淀重悬于TDB缓冲液（10 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、0.1 mM EDTA、0.02% NaN?，pH 7.8）中并在碱性条件下处理以有效去除rapsyn。然后用CyclAPol（C8C050）以聚合物/总IMP质量比1:1在4°C下于TBD缓冲液中增溶膜1小时，含或不含50 mM β-巯基乙醇。溶液离心后，上清液上样至乙酰胆碱修饰的亲和柱。柱子用不含聚合物的含250 mM NaCl的TBD缓冲液洗涤，nAChR用补充20 mM卡巴胆碱的相同缓冲液洗脱。去污剂增溶的nAChR首先使用1% Triton? X-100提取，然后在亲和柱纯化过程中将Triton X-100交换为DDM（0.34 mM），然后洗脱。样品随后对TDB缓冲液透析用于CyclAPol纯化的nAChR，对补充DDM的TDB缓冲液透析用于DDM纯化的nAChR。
**6.2. GLIC纯化**
GLIC蛋白生产如前所述。简言之，麦芽糖结合蛋白（MBP）-GLIC融合蛋白在BL21大肠杆菌细胞中于20°C下用100 μM IPTG诱导过夜表达。收集细胞并重悬于含20 mM Tris、300 mM NaCl（pH 7.4）的缓冲液A中，随后通过超声破碎。超速离心分离膜后，IMPs在补充2% DDM的缓冲液A中过夜提取。超速离心后，上清液与直链淀粉树脂孵育，MBP-GLIC使用补充0.02% DDM和饱和浓度麦芽糖的缓冲液A洗脱。为去除内源麦芽孔蛋白污染物，在含0.02% DDM的缓冲液A中进行superose 6 10/300 GL上的第一次尺寸排阻色谱。测量GLIC-MBP浓度，蛋白质与凝血酶在4°C下孵育过夜以切割MBP。然后进行第二次凝胶过滤以去除MBP。GLIC样品在液氮中快速冷冻并在测量前储存于-80°C。
**6.3. 质光光度法**
MP测量使用TWOMP设备在室温下进行。显微镜载玻片用milli-Q水、异丙醇、milli-Q水清洗并用干净氮气流干燥。六孔可重复使用硅胶垫圈被仔细切割并组装在载玻片中心。放置在质光光度计中后，在每次采集前，将18 μL PBS液滴放入一个孔中以实现对玻璃表面的聚焦。
**6.4. 对比度-质量校准**
为允许MP质量测量，每天进行两次对比度-质量校准，通过测量可溶性蛋白质混合物，包括牛血清白蛋白（66 kDa）、曲妥珠单抗（149 kDa）和谷氨酸脱氢酶（318 kDa）在PBS缓冲液（pH 7.4）中。散射事件分布使用DiscoverMP进行高斯拟合。对比度值使用对比度与结合物体质量之间的线性关系转换为质量。校准在R2>0.998且质量误差<5%时被接受。
**6.5. GLIC的质光光度法测量**
GLIC样品首先用其纯化缓冲液稀释至1 μM，随后在PBS中稀释。将少量等分试样（0.5-2 μL）滴加稀释并小心混合到19.5-18 μL PBS液滴中以达到50-200 nM的最终浓度。使用AcquireMP软件为每个样品记录三个3000帧的视频（60秒）。
**6.6. Tm-nAChR样品质量控制的质光光度法测量**
Tm-nAChR样品首先在PBS中稀释至1 μM、300 nM和100 nM。然后将每个稀释液的1-2 μL等分试样滴加稀释到19-18 μL PBS液滴中，获得100-50-30-10-5 nM的最终浓度系列。使用AcquireMP软件为每个样品记录三个3000帧的视频（60秒）。
**6.7. Tm-nAChR还原筛选的质光光度法测量**
Tm-nAChR样品首先在PBS中稀释至1 μM，然后通过将2 μL样品添加到含指定还原剂（TCEP、β-巯基乙醇或DTT，终浓度为0、0.01、0.1、1、10、30、50和80 mM）的10 μL终体积PBS中进一步稀释至200 nM。样品通过将1 μL样品滴加稀释到19 μL PBS液滴中并轻轻混合以达到10 nM直接分析。对于每种还原条件，样品立即分析并在37°C下90分钟后再次分析。在每种情况下，使用AcquireMP软件为每个样品记录三个3000帧的视频（60秒）。
**6.8. Tm-nAChR样品的尺寸排阻色谱（SEC）分析**
SEC使用连接到?kta pure?系统的Superose 6 10/300 GL柱进行，并由Unicorn 7采集软件控制。样品注射前，柱子用无聚合物TDB缓冲液平衡。注射100 μL浓度为1 g·L?1的样品进行分析。蛋白质洗脱通过280 nm吸光度监测。
**6.9. 负染色电子显微镜**
来自Tm电器官的膜在没有还原剂的情况下用C8-C0–50增溶。亲和纯化后，通过制备性SEC分离对应于nAChR五聚体形式的洗脱峰。将几微升纯化的nAChR样品（30 μg·mL?1）施加到碳包被网格上，用乙酸铀酰负染色，随后通过电子显微镜成像。
**6.10. 质光光度法评估缓冲液交换**
**6.10.1. 在线缓冲液交换**
在线缓冲液交换使用NativePac OBE-1 SEC柱在ACQUITY UPLC H-Class系统上对DDM-nAChR样品进行，样品输出手动收集用于MP表征。缓冲液交换的流动相为200 mM乙酸铵（pH 8.0），含不同去污剂（DDM、C8E4、LDAO），浓度为两倍CMC。对于MP分析，将1-2 μL收集的样品滴加稀释到18-19 μL PBS液滴中。
**6.10.2. 手动缓冲液交换**
DDM-nAChR样品使用Bio-Spin微量离心柱交换到补充去污剂（DDM、C8E4、LDAO）至两倍CMC浓度的200 mM乙酸铵缓冲液（pH 8.0）中。样品随后在MP分析前在乙酸铵缓冲液中稀释20倍。然后，将1 μL缓冲液交换的nAChR样品滴加稀释到19 μL PBS液滴中。
**7. 讨论/展望**
**MP用于IMP研究的优势：** 对于IMP，MP在广泛的膜模拟系统中表现出卓越的适应性。其简单的实施、易于操作以及在单颗粒水平进行动态过程时间分辨测量的能力使其成为结构生物学工具库中的宝贵补充。在本研究中，MP能够定量表征共价和非共价相互作用，如Tm-nAChR十聚体的还原筛选所示。MP与已建立的生物物理方法如SEC-MALS和DLS高度互补和正交，提供样品均质性、寡聚状态和在不同膜环境中稳定性的快速评估。测量通常可在几分钟内完成，仅使用纳摩尔浓度的样品，使MP对材料通常受限的IMP项目特别有吸引力。虽然IMP应用可能因膜模拟物的复杂性而需要额外优化，但通常在有限用户培训后即可获得稳健且有信息的测量结果。
**MP的技术和应用局限性：** 尽管MP具有在单颗粒水平直接解析分子质量分布的能力，但仍受若干技术和概念限制。校准对IMP仍然是一个特殊挑战，因为可用的校准标准品主要由球状蛋白质组成。相比之下，IMP样品含有不同量的脂质、去污剂、聚合物和其他膜模拟物，其不同的极化率可能影响散射对比度与分子质量之间的关系。因此，开发针对IMP系统定制的校准标准品将提高定量质量精度。此外，低分析物浓度虽然最小化样品消耗，但可能减少检测到的结合事件数量，从而限制质量分辨率。小分子配体（低于千道尔顿范围）的检测仍然特别具有挑战性，因为相关的质量偏移通常低于仪器噪声和膜模拟物背景施加的实际分辨率限制。最后，由于MP测量通常在高度稀释条件下进行，观察到的寡聚分布可能并不总是反映功能或生理条件下复合物的行为。
在应用范围方面，MP除分子质量和化学计量外提供的结构信息很少，阻碍了蛋白质结构、构象状态或相互作用界面的直接表征。其次，MP仅测量颗粒的总质量，因此无法明确区分膜蛋白复合物中蛋白质、脂质、去污剂、聚合物或其他相关组分的个体贡献。这一限制对IMP尤其相关，因为膜模拟物可能构成测量质量的相当大部分。第三，MP对结合动力学和动态过程的洞察有限，因为它不直接提供缔合或解离速率常数，不太适合研究瞬时相互作用或复杂反应机制。因此，MP在与能提供分子组成、结构细节和动力学信息的互补结构和生物物理技术结合使用时最为强大。例如，与SEC-MALS、天然MS或电荷检测质谱（CD-MS）等互补方法进行更系统的比较，对于建立参考数据集和基准跨不同IMP组装体的质量精度将很重要。
**MP与更经典生物物理和天然MS方法的定位比较：** 与其他用于测定生物分子组装体质量的方法相比，MP在实施、速度、样品消耗和灵敏度方面具有明显优势。例如，MP和SEC-MALS是基于光散射的技术，提供质量信息，但方式不同。SEC-MALS需要准确指定折射率增量（dn/dc）以对所有样品组分进行相对定量，无需校准即可获得可靠分子质量。对于含蛋白质、脂质、核酸、去污剂或聚合物的异质组装体，这些要求可能引入额外的不确定性。然而，通过将光散射与吸光度测量相结合，SEC-MALS可以估计复合物内不同组分的各自质量贡献，这是MP单独无法提供的组成分辨水平。SEC-MALS测量还依赖于充分色谱分离，因为分辨率不足可能导致不同群体平均。
与天然MS相比，MP在较低样品浓度下操作（通常约1-100 nM，而低微摩尔浓度），需要最小的样品制备，并在几分钟内提供结果。其可及质量范围特别适合大型膜蛋白组装体，从约40 kDa延伸至数兆道尔顿。相反，天然MS和CD-MS与MP相比提供显著更高的质量精度和分辨率，能够进行精确化学计量分配、配体结合表征和较小蛋白质组装体分析。然而，这些基于MS的技术通常需要更广泛的样品制备、更严格的缓冲液兼容性和更大的操作员专业知识。采集时间也更长，特别是CD-MS测量（每次CD-MS测量约30分钟至1小时）。这些方法的互补性质通过SMALP增溶的WabP复合物研究得到例证，CD-MS和MP分别产生高度一致的质量243±12 kDa和239±28 kDa。总之，这些技术形成高度互补的工作流程，其中MP实现样品质量、寡聚状态、稳定条件和缓冲液交换结果的快速筛选，而天然MS提供优化样品的高分辨率组成和化学计量表征。
**MP用于IMP研究的未来展望：** 迄今为止，大多数IMP的MP研究集中在纯化的重组蛋白和相对明确的组装体上。最近，应用已扩展到IMP/受体或IMP/配体结合的表征。例如，Castel等人证明了使用MP监测GPCR/G蛋白受体复合物的形成，而Robinson课题组报道了使用MP定量IMP/蛋白质相互作用，使用肽盘重构的外膜嵌入五聚体BAM
