《Biofilm》：Beyond surface scraping to understand fluvial biofilms: an electron microscopy analysis of the rock–biofilm interface in Antarctic meltwater streams
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摘要翻译：刮取会破坏河流生物膜的空间组织；保留的生物膜–岩石界面揭示了群落聚集的空间特征；刮取会掩盖内石定殖和微生物–矿物相互作用；交替的微生物富集层与沉积物富集层可能记录了水文历史；将原位显微术与组学方法相结合，可弥合结构与多样性之间的鸿沟。
摘要翻译：刮取会破坏河流生物膜的空间组织；保留的生物膜–岩石界面揭示了群落聚集的空间特征；刮取会掩盖内石定殖和微生物–矿物相互作用；交替的微生物富集层与沉积物富集层可能记录了水文历史；将原位显微术与组学方法相结合，可弥合结构与多样性之间的鸿沟。
论文解读文章
**一、研究背景与现存问题**
河流生物膜是河流生态系统中最主要的微生物生命形式之一，主要由细菌、藻类、真菌和原生动物嵌入自身分泌的胞外聚合物（EPS）基质中形成，广泛定殖于岩石、沉积物、木质残体、枯落物及大型植物等水下表面。通过初级生产、呼吸、有机物分解、养分循环和污染物转化等过程，河流生物膜在生态系统功能中发挥核心作用，并被视为环境变化的敏感指示生物。近二十年来，分子生物学技术如宏条形码和宏基因组学极大推进了对生物膜多样性与功能潜力的认识；显微技术也常用于量化细胞数量、检测EPS并估算厚度和覆盖率。然而，无论是分子分析还是常规显微观察，绝大多数研究在采样时首先通过刮取或刷洗将生物膜从天然基质上剥离，再进行均质化处理。这种破坏性采样虽然便于操作且有利于跨样本比较，但不可避免地破坏了微生物细胞与EPS原有的三维空间排布，并割裂了生物膜与岩石基底之间的物理联系，导致生物膜结构坍塌为均质悬浮液。同时，牢固附着于基质或生活于岩石内部的微生物可能未被完全回收，从而在群落组成分析中造成偏差。因此，如何保留原始岩石–生物膜界面并解读其空间组织信息，成为河流生物膜生态学研究中长期被忽视的关键维度。
**二、研究内容与意义**
针对上述问题，该研究采用原位显微术（in situ microscopy），即不将生物组分与其天然基质分离，而是直接对完整的岩石–生物膜复合体进行显微观察。研究以南极利文斯顿岛西班牙南极站胡安·卡洛斯一世站附近的四条融水溪流为对象，于2024年2月采集带有可见生物膜的岩石样本，并利用场发射扫描电子显微镜（FESEM）和低温场发射扫描电子显微镜（LT-FESEM）互补分析岩石–生物膜界面，揭示破坏性采样易忽略的结构特征和地球微生物学相互作用。研究还通过实验性刮取岩石，直接评估常规采样方法对生物膜结构的扰动程度。该研究发表于《Biofilm》，其意义在于提出河流生物膜应被视为具有空间结构的“石生生物膜”（lithobiontic biofilm），并倡导将原位结构分析与分子多样性分析相结合，以更完整地理解河流生物膜的组织形式与群落构建机制。
**三、主要关键技术方法**
研究人员采用的主要技术方法包括：其一，原位显微术中的FESEM背散射电子模式，用于观察树脂包埋后抛光断面上的岩石–生物膜界面；其二，LT-FESEM，用于观察水合状态下仍保持三维结构的生物膜，通过冷冻断裂、蚀刻和镀铂后成像；其三，实验性刮取结合LT-FESEM，用于比较刮取后残留的附着组分。样本采集自南极四条融水溪流（BAE Stream、Nautica Stream、Argentinian Cove Stream和Sally Rocks Stream），每溪流选取5块发育良好且未受扰动的岩石，共20块。全部样本均先经立体显微镜评估生物膜状态，再在?20°C保存后运送至实验室处理。
**四、研究结果**
**4.1 空间结构与组织**
通过FESEM与LT-FESEM观察，研究发现尽管生物膜宏观形态在同一溪流内和不同溪流间均存在差异（从薄的绿色层状到厚的海绵状褐色或绿色），但所有生物膜共享一致的空间组织特征：它们是高度有序的三维结构，蓝藻、硅藻和绿藻等形态型共同嵌入EPS基质中，但空间分布不同。基底层始终由球菌状和丝状蓝藻主导，直接接触岩石表面；其上覆盖丝状形态型，部分样本中再上层为硅藻。细菌样菌落常与蓝藻和藻类丝状体相关。丝状微生物形成互联网络，EPS基质内还截留了小型矿物碎片。LT-FESEM特别清楚地显示了EPS基质的三维网络。此外，岩石表面观察到地衣叶状体，但与河流生物膜在结构上相互独立。
**4.2 生物膜–岩石界面与内石定殖**
显微观察显示EPS形成连续基质，将微生物细胞与矿物表面紧密连接。大量与表层生物膜形态相似的微生物细胞出现在岩石内部裂隙、孔隙和腔隙中，表明存在内石（endolithic）生物膜组分。该内石区室主要由蓝藻和疑似异养细菌的菌落组成。在某些区域，微生物细胞与成分上类似周围基质的矿物碎片紧密关联。实验性刮取后的LT-FESEM观察表明，尽管刮除移除了大部分上层生物膜，但微生物细胞和大量EPS仍牢固附着于岩石表面，且丝状蓝藻可占据岩石表层空腔。
**4.3 多层状生物膜结构**
在部分生物膜区域，微生物细胞尤其是丝状形态被细粒沉积物包裹，这可能与生物矿化过程有关。多块岩石上的生物膜呈现交替的微生物富集层和沉积物富集层的多层结构。沉积物富集层含大量矿物颗粒、岩石碎片和空的硅藻壳；相邻微生物富集层则以嵌入EPS中的丝状微生物为主。丝状微生物常跨越沉积物层，连接相邻的微生物层。这种交替层状组织可能记录了水文波动下生物膜反复发育、埋没和再定殖的历史。
**五、讨论总结与结论**
讨论部分指出，破坏性采样不仅消除三维结构，还可能使群落组成分析产生偏向。实验性刮取证明常规刮取无法完全剥离生物膜–岩石关联，导致紧密附着的表层微生物和内石群落被低估，而松散的浅层或暂居微生物可能被高估。原位观察揭示的重复性垂直序列——基底层蓝藻附着于岩石表面、上层被其他形态型覆盖——与依次定殖过程相容，但静态显微图像不能确证演替，仍需时间序列或空间分子分析。内石定殖作为河流生物膜中被忽视的组分，可能为微生物提供冰冻、干燥、强辐射和长期黑暗等极端环境下的庇护所，有助于群落长期续存。微生物与矿物的紧密联系以及交替形成的有机–沉积结构，则暗示岩石–生物膜界面是地球微生物活跃区域，EPS产生和代谢活动可能促进岩石风化与养分动员，但部分矿物颗粒也可能仅为被动截留，需借助EDX元素图谱、同位素分析或时间序列实验加以区分。最终，研究人员强调在常规刮取样本之外保留部分完整定殖岩石，可将原位显微术与分子多样性分析整合，为解释群落组成提供空间背景，并指导对强附着、内石及沉积物相关组分的靶向取样。
**结论**：本研究表明南极融水溪流中的河流生物膜并非惰性矿物表面上的单纯微生物聚集体，而是空间结构化的石生生物膜。通过保留岩石–生物膜界面，原位显微术揭示了生物膜组分间复杂的空间关系、与基岩的紧密联系以及表石与内石区室共存的现象。尽管此发现来自南极融水溪流，类似的复杂结构可能存在于全球河流生物膜中。整合结构信息与分子信息是弥合微生物群落组成与空间组织之间长期存在的鸿沟的关键，未来应利用空间组学、自动图像分析及非破坏性成像技术，在更大的定量尺度上深化这种整合研究。
