《Biomaterials》：Micro/nanoscale bubble-mediated mucolytic conditioning of the lung model of cystic fibrosis enhances nanoparticle transport through the mucus.
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摘要囊性纤维化（CF）是一种具有严重肺部表现的单一基因疾病。目前正研究用于CF的药物和基因治疗的纳米粒子载体，但仅有少数能够穿透CF肺部高度浓缩且由二硫键交联的气道粘液。在此，我们开发了一种与粘液溶解相关的多分散微/纳米级气泡制剂（MNB），该制剂将还原化学物质（三（2-羧乙基）
摘要
囊性纤维化（CF）是一种具有严重肺部表现的单一基因疾病。目前正研究用于CF的药物和基因治疗的纳米粒子载体，但仅有少数能够穿透CF肺部高度浓缩且由二硫键交联的气道粘液。在此，我们开发了一种与粘液溶解相关的多分散微/纳米级气泡制剂（MNB），该制剂将还原化学物质（三（2-羧乙基）膦，TCEP）与超声响应载体结合，以破坏粘液。我们评估了模型纳米载体在经过MNB-TCEP处理后通过模拟CF粘液水凝胶的渗透情况。在相同的还原等效剂量下，MNB-TCEP显著提高了200纳米阴离子纳米粒子的渗透率，相较于PBS和游离TCEP都有明显效果。在更严格的厚粘液条件下，治疗性超声使MNB-TCEP组的阴离子纳米粒子渗透率提高了约3.5倍，而PBS和游离TCEP对照组则没有显著差异。MNB-TCEP在凝胶模型中保持了超声可见性，并在离体猪肺部的可液滴接触、非通气成像窗口内产生了与气道相关的回声信号。此外，在测试的方案中，无论是否使用超声，MNB-TCEP均未降低离体气管活检的急性存活率。引入AAV1报告基因表明，气泡-超声处理可能增加气道上皮中报告基因的局部表达。综上，这些数据表明，与粘液溶解相关的MNB制剂是一种增强纳米载体通过模拟CF粘液传递的诊疗策略，其探索性组织水平数据支持进一步评估其在基因传递应用中的潜力。
引言
尽管核酸治疗和基因传递载体在治疗囊性纤维化（CF）的致命性肺部病变方面具有巨大潜力，但其临床转化受到关键物理障碍的限制，主要是由气道粘液造成的[1]、[2]、[3]。在病理性的CF环境中，粘液是一种结构复杂的凝胶，限制了内源性因子和外源性治疗载体的传输[4]、[5]、[6]、[7]。在CF及相关黏液阻塞性状态下，厚粘液增加了网络密度并减少了有效孔隙间距[4]、[8]，而可化学靶向的连接点（如形成凝胶的粘蛋白中的二硫键，例如MUC5B和MUC5AC）则增加了粘液的硬度[9]、[10]。基因载体和纳米粒子载体受到这种密集物理化学屏障的阻碍，使得粘液网络成为气道内传递的关键限制因素[6]、[11]、[12]。虽然聚乙二醇（PEG）化可以减少黏附作用，但高度PEG化的纳米粒子通常仍无法有效穿透类似CF的粘液屏障，因为高度浓缩的交联网络会物理性地捕获载体[13]、[14]。这些观察结果促使人们探索积极重塑粘液网络的策略，以实现纳米治疗物质的传输。
为了破坏交联的粘蛋白网络，已经研究了基于巯基的粘液溶解剂（如N-乙酰半胱氨酸NAC），作为辅助手段来改善通过CF痰液的传输[12]。然而，NAC通常需要高浓度和/或在气道表面停留较长时间才能实现有效的二硫键还原和粘液溶解[9]、[15]。相关的粘液溶解方法，包括新的含巯基化合物，在CF相关的痰液、模拟粘液的屏障以及黏液阻塞性模型中也显示出活性[14]、[16]、[17]。其中，基于膦的还原剂（如三（2-羧乙基）膦（TCEP）能够在富含粘蛋白的系统中破坏二硫键，逆转过敏性气道疾病模型中的病理粘液功能障碍，并增强纳米粒子通过模拟粘液屏障的渗透[10]、[14]。然而，自由溶解的粘液溶解剂的临床应用受到气道表面液体稀释和暴露时间有限的限制，因为沉积的药剂会受到纤毛清除和上皮吸收的影响，从而削弱了切割广泛粘蛋白二硫键所需的持续局部还原作用[15]。这促使人们开发能够在局部浓缩还原剂并延长其在粘液界面上有效暴露时间的传递策略。
超声响应的微/纳米级气泡系统越来越被视为具有多功能性的工具，可用于触发释放和调节屏障[18]、[19]、[20]，部分原因是声学驱动的气泡活动可以产生局部微尺度应力，从而暂时扰乱生物基质[21]、[22]、[23]。在感染相关的生物膜中，超声驱动的气泡活动可以破坏基质并增强抗菌或免疫介导的清除作用[24]、[25]，尤其是在肺部相关环境中[26]。然而，生物膜和病理性的交联粘液作为具有不同物理化学特性的屏障。因此，关于肺泡的研究主要集中在破坏生物膜[26]和增强对比度[27]、[28]，而不是化学重塑二硫键交联的粘蛋白网络。因此，作为化学机械破坏剂的气泡系统可以通过结合局部粘液溶解作用与超声驱动的激活来实现治疗性传递，从而增强纳米载体的渗透。
在这里，我们介绍了一种基于气泡的生物材料平台，该平台将生化还原能力与超声响应的机械活性结合在一起。为此，使用带有阳离子多分散微/纳米级气泡制剂（MNB-TCEP）在粘液网络处浓缩还原剂。如图1所示，粘液溶解相关的MNB处理旨在化学上削弱二硫键交联的粘液，而超声则提供声学/机械破坏步骤。制剂基于还原剂等效量进行了标准化，并通过Transwell测试其在模拟CF粘液中的纳米粒子渗透情况来评估屏障调节效果。诊疗潜力通过以下方式进行了评估：（i）在凝胶模型和离体肺部的可液滴接触、非通气气道区域测试气泡依赖的超声可见性；（ii）响应MNB-TCEP和超声的离体组织存活率；（iii）MNB-TCEP和超声处理后的AAV1报告基因读数。这种化学机械气泡平台可能提供一种新的气道调节策略，以暂时重塑病理粘液，从而改善吸入或腔内传递的基因载体和其他纳米治疗物质对患病CF气道的访问。
部分摘录
材料与设备
微/纳米级气泡脂质包括二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC；Cayman Chemical）、1,2-硬脂酰-3-三甲基铵丙烷（DSTAP；Nanosoft Polymers）和PEG-40硬脂酸酯（Sigma-Aldrich）；粘液溶解剂包括NAC（Sigma-Aldrich）和TCEP·HCl（GoldBio）。使用的共溶剂为丙二醇（MP Biomedicals）和甘油（Sigma-Aldrich）。Ellman反应所需的试剂为5,5-二硫-双（2-硝基苯甲酸）（DTNB，Ellman试剂；Sigma-Aldrich）和Tris碱（EMD Millipore）。
伦理声明
死后猪组织（未经处理的肺和气管）是通过哥伦比亚大学组织共享计划从用于无关终末程序的动物中获得的。未对活体动物进行任何操作。
MNB制剂的制备和物理化学表征
我们首先确认了MNB制剂是否可以重复制备，以及所得制剂是否保留了下游传输研究所需的物理化学特性。MNB制剂是通过脂质薄膜水化和超声乳化生成的（图1；图2A）。在不同制剂（MNB-Cation、MNB-NAC、MNB-TCEP）中，悬浮液外观上看起来是均匀的，而明场显微镜检查显示是包含异质球形气泡群体
讨论
我们发现，与粘液溶解相关的微/纳米级气泡处理可以改善纳米粒子通过模拟CF气道粘液的传输，这是药物和基因传递到患病肺部的主要障碍之一。鉴于导致呼吸衰竭的进行性肺病仍是CF的主要发病率和死亡率原因[34]、[35]，因此改善通过高浓度、交联气道粘液的传递方法是解决这一关键转化挑战的方法[9]。在这里，最有效的
结论
总体而言，收集的数据表明，与粘液溶解相关的MNB制剂是一种用于模拟CF病理粘液的综合调节策略，在一个具有挑战性的200纳米阴离子纳米粒子测试案例中，MNB-TCEP比游离TCEP显示出更强的传输优势。治疗性超声仅在最严格的屏障配置下为MNB-TCEP提供了额外的传输优势，这与气泡介导的声学机械作用局部化效应一致
CRediT作者贡献声明
Alexander Romanov：撰写 – 审稿与编辑，资源提供。Arvind Nandakumar：撰写 – 审稿与编辑，资源提供。Panpan Chen：撰写 – 审稿与编辑，概念构思。Mohammad Mir：撰写 – 审稿与编辑，资源提供，概念构思。Jinho Kim：撰写 – 审稿与编辑，资源提供，概念构思。Ylleana Goduco：资源提供。Jiawen Chen：资源提供，概念构思。Aneri Patel：撰写 – 审稿与编辑，资源提供，概念构思。Meghan Pinezich：撰写 – 审稿与
数据可用性
所有收集的数据都包含在文章和补充信息中。额外的成像、超声和平板读取文件可应要求从相应作者处获取。
写作过程中使用的人工智能和人工智能辅助技术的声明
作者使用ChatGPT（OpenAI）作为人工智能辅助工具来支持手稿写作，以提高清晰度、语法和可读性。人工智能未用于生成或操作数据、进行分析或创建图表。所有科学内容、解释和结论均由作者开发。作者审阅、编辑并验证了所有人工智能辅助的文本，并对本文的内容负全责。
资金来源
本工作得到了囊性纤维化基金会（Pioneer资助编号VUNJAK23XX，授予G.V.N.和J.K.）、国家生物医学成像与生物工程研究所（P41 EB027062，授予G.V.N.）以及美国国立卫生研究院（T32 HL007854-30）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们感谢哥伦比亚大学比较医学研究所（ICM）在死后组织采集及相关动物设施协调方面的支持。我们还要感谢Santos Cabreriza博士和Giovanni Ferrari博士提供的肺组织，以及Kam W. Leong博士分享的设备。我们感谢哥伦比亚大学Herbert Irving综合癌症中心的共聚焦和专用显微镜共享资源，允许我们使用他们的设施进行活体组织成像。
Mohamed Diane|Maria R. Hudock|Julie Leonard-Duke|Arvind Nandakumar|Ylleana Goduco|Mohammad Mir|Aneri Patel|Jiawen Chen|Veronica Farag|Meghan R. Pinezich|Julie Van Hassel|Alexander Yoon|Rahul Kanade|Panpan Chen|Alexander Romanov|Jinho Kim|Gordana Vunjak-Novakovic
哥伦比亚大学生物医学工程系，美国纽约州纽约市
