《Biomaterials Advances》：GSH-responsive nanoparticle drug delivery system for simultaneous blockade of CD73/A2AR to reverse adenosine-mediated immunosuppression
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设计了新型结合物，能够同时阻断腺苷免疫抑制途径中的CD73和A2AR。
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设计了新型结合物，能够同时阻断腺苷免疫抑制途径中的CD73和A2AR。
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这些结合物能自组装成具有优异稳定性和肿瘤靶向能力的GSH响应型纳米颗粒。
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主要制剂BSC纳米颗粒在4T1乳腺癌模型中显著抑制了肿瘤生长并促进了T细胞的浸润。
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BSC纳米颗粒与抗PD-L1抗体的联合疗法展现了协同的抗肿瘤效果和免疫激活作用。
引言
癌症免疫疗法的出现标志着肿瘤治疗的重大转变[1]、[2]、[3]。针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）和程序性死亡-1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L1）的免疫检查点抑制剂（ICIs）在多种实体瘤中表现出突破性的疗效，重塑了临床肿瘤学的治疗格局[4]、[5]、[6]、[7]。然而，随着ICIs在临床上的应用不断扩大，其局限性也日益明显：大多数患者会出现原发性或继发性耐药性，免疫相关不良事件（irAEs）表现出很大的异质性，而且整体响应率受到肿瘤免疫微环境（TME）内个体间差异的限制[8]、[9]、[10]、[11]。在这个微环境中，腺苷（ADO）在TME中发挥强烈的免疫抑制作用，显著降低了PD-1/PD-L1阻断疗法的疗效[12]、[13]、[14]、[15]。因此，腺苷信号通路作为关键的免疫调节轴在肿瘤免疫学领域引起了广泛关注[16]、[17]、[18]。该通路的激活始于TME中胞外ATP（eATP）的积累，这些ATP主要来自坏死肿瘤细胞或被化疗或放疗损伤的细胞[19]、[20]。eATP随后被外酶CD39水解为AMP，再由关键酶CD73进一步催化生成具有强免疫抑制活性的ADO[21]。腺苷通过A2A和A2B受体在肿瘤微环境（TME）中产生双重免疫抑制效应：它直接抑制效应T细胞和自然杀伤（NK）细胞的抗肿瘤功能，同时促进免疫抑制细胞的招募和功能极化，如调节性T细胞（Tregs）、髓系来源的抑制细胞（MDSCs）和M2型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）[22]、[23]、[24]。这种级联反应最终形成了一个促进肿瘤免疫逃逸和恶性进展的免疫抑制微环境[25]、[26]、[27]。
尽管针对腺苷信号通路的小分子抑制剂（如CD73抑制剂AB680和A2AR拮抗剂CPI-444）已逐步进入临床研究阶段，但单一疗法在肿瘤学中的疗效仍然有限[28]、[29]、[30]、[31]。临床前和临床研究表明，同时阻断腺苷的产生（由CD73介导）及其下游信号转导（通过A2AR）可以产生明显的协同免疫调节效应，从而更有效地逆转肿瘤的免疫抑制微环境[32]。基于这些证据，我们提出了一种新的协同抑制策略：将CD73抑制剂与A2AR拮抗剂进行化学结合，以实现腺苷通路上下游成分的同时抑制。
我们的团队通过基于目标的筛选发现，五环三萜天然产物白桦素酸（BA）具有广谱抗肿瘤活性，是CD73的强效抑制剂（IC?? = 7.28 μM）[33]、[34]。为了实施这一策略，选择BA作为CD73抑制基团，并通过含有二硫键的连接剂与A2AR拮抗剂CPI-444（Ki = 3.54 nm）进行化学结合。这种二硫键（-S-S-）可以在肿瘤微环境中高浓度的还原型谷胱甘肽（GSH）作用下发生氧化还原反应而被断裂，从而实现靶向药物释放[35]、[36]、[37]。这种机制在抗肿瘤药物设计中得到广泛应用。我们之前的研究表明，在二硫键连接剂之间引入短链聚乙二醇（PEG）间隔物可以显著提高结合物的疗效[38]。基于这一发现，本研究设计并合成了两种药物结合物BSC和BSPC，用于后续比较研究（方案1）。在BSC中，药物通过二硫键直接结合；而在BSPC中，则使用复合的二硫键-短链PEG连接剂进行连接。为了解决传统小分子药物的局限性，如肿瘤靶向性差和由于组织分布广泛导致的系统性毒性，我们通过自组装方法成功制备了BSC纳米颗粒和BSPC纳米颗粒[39]、[40]、[41]。该系统利用纳米颗粒独特的增强渗透性和滞留（EPR）效应，在肿瘤组织内高效积累药物，从而提高抗肿瘤疗效的同时减少系统性毒性[42]、[43]、[44]。这种集成方法实现了定位药物递送和智能释放，优化了治疗效果和安全性[45]。在体外模拟的氧化还原条件下，这些纳米颗粒表现出有效的药物释放和良好的生物相容性。在4T1 TNBC模型中，这种纳米系统不仅作为单一疗法显示出显著的抗肿瘤疗效，并有效激活了肿瘤浸润的T细胞，而且与PD-L1抗体治疗联合使用时还展示了显著的协同效应。
节片
材料与试剂
Triphosgene、白桦素酸、DSPE-PEG2000和Amino-PEG4-Boc购自上海Bide Pharmaceutical Technology Co., Ltd。DMAP、[Pd(PPh?)?]、EDCI、烯丙基溴化物、TFA、碳酸钾、二氯甲烷（DCM）、四氢呋喃（THF）和二硫苏糖醇（DTT由上海Titan Technology Co., Ltd.提供。
CCK-8试剂盒、PBS、RPMI-1640培养基和FBS由Beyotime Biotechnology Co., Ltd.（上海）提供。4%兔红细胞悬浮液由南京提供。
BSC和BSPC的合成
目标结合物BSC的合成是通过CPI-444和BA之间的二硫键连接实现的，如图1A所示。合成过程首先使用烯丙基溴化物保护BA的羧基功能，形成IN-1。随后将该保护后的化合物与含有二硫键的双功能连接剂偶联，得到IN-2。进一步处理使得IN-2与CPI-444发生反应
结论
总之，本研究成功设计并开发了一种GSH响应型纳米颗粒平台，用于协同递送CD73抑制剂和A2AR拮抗剂，以对抗肿瘤微环境中的腺苷介导的免疫抑制。合成了两种新型结合物BSC和BSPC，并将其制备成相应的纳米颗粒（BSC NPs和BSPC NPs）。所得纳米颗粒表现出良好的胶体稳定性、均匀的尺寸分布，并且
CRediT作者贡献声明
Chuanhao Wang：撰写——初稿、研究、数据管理、概念构思。 Yangyang Gong：研究、概念构思。 Daozuan Zhang：研究。 Chengyi Huang：研究。 Hongling Wang：研究。 Peixian Chen：研究。 He Zhang：撰写——审阅与编辑、监督。 Huojun Zhang：撰写——审阅与编辑、监督、资金筹集。 Junwu Zhu：撰写——审阅与编辑、监督、概念构思。 Zhenyuan Miao：撰写——审阅与编辑。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性财务利益或个人关系。
致谢
我们衷心感谢国家自然科学基金（82173743、82272742和82473233）的财政支持。
Chuanhao Wang|Yangyang Gong|Daozuan Zhang|Chengyi Huang|Hongling Wang|Peixian Chen|He Zhang|Huojun Zhang|Junwu Zhu|Zhenyuan Miao
