《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Structure-based design of a 1
H-Tetrazole-containing scaffold for Caspase-1 inhibition: Synthesis, biological evaluation, and preliminary in Vivo studies
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炎症小体是先天免疫应答的核心机制之一，研究人员的报告表明，炎症小体激活失调与多种疾病相关，包括自身免疫性疾病、炎症性疾病、细胞因子风暴综合征、癌症、神经退行性疾病和代谢性疾病。Caspase-1作为炎症小体信号传导的关键效应分子，其异常激活与银屑病、关节炎、代
炎症小体是先天免疫应答的核心机制之一，研究人员的报告表明，炎症小体激活失调与多种疾病相关，包括自身免疫性疾病、炎症性疾病、细胞因子风暴综合征、癌症、神经退行性疾病和代谢性疾病。Caspase-1作为炎症小体信号传导的关键效应分子，其异常激活与银屑病、关节炎、代谢性疾病、心血管疾病、神经系统疾病以及杜氏肌营养不良症等多种疾病相关。尽管已有多种caspase-1抑制剂进入临床前研究，但由于安全性和毒性问题，其临床转化受到限制。本研究基于先前报道的1,5-二取代α-氨基四唑caspase-1抑制剂，采用骨架多样化和生物电子等排体替换策略，设计并合成了一系列结构新颖的含1H-四唑骨架的caspase-1非共价抑制剂。研究人员通过Ugi-四唑多组分反应（UT-4CRs）合成了目标化合物，并评价了其体外caspase-1抑制活性。其中，化合物6e和6f表现出最高的抑制活性，IC??值分别为380 nM和360 nM，较先前报道的系列化合物活性提高了约30倍。初步体内研究表明，化合物6e在mdx小鼠模型中显示出改善肌肉力量和协调性的趋势，且在小鼠肌细胞中未观察到明显毒性。分子动力学模拟揭示了化合物6e的两种对映异构体在caspase-1活性位点中的不同结合模式和构象偏好。
研究背景与问题：Caspase-1是炎症小体信号通路的关键效应蛋白酶，负责将pro-IL-1β、pro-IL-18和Gasdermin D前体加工为活性形式，从而驱动炎症反应和焦亡。caspase-1的异常激活与多种炎症性疾病、自身免疫性疾病、神经退行性疾病以及杜氏肌营养不良症（DMD）等密切相关。尽管caspase-1抑制剂在临床前模型中显示出治疗潜力，但仅有少数候选药物进入临床评估，最终因安全性和毒性问题而失败。许多已报道的抑制剂为共价抑制剂，虽然体外活性较强，但往往存在选择性差和药理学性质不佳的问题。目前，缺乏结构多样化且药理学优化的非共价caspase-1抑制剂仍是亟待解决的挑战。研究人员此前报道了1,5-二取代α-氨基四唑类caspase-1抑制剂，为避免共价修饰催化半胱氨酸，采用不可断裂的4-氨基-3-羟基丁酸骨架替代可断裂的天冬氨酰部分。在此基础上，本研究进一步探索结构多样性，以1H-四唑作为羧酸生物电子等排体，设计了结构新颖的非共价caspase-1抑制剂骨架，旨在扩展四唑类抑制剂化学空间并提高抑制活性。
研究方法：研究人员采用基于结构的药物设计策略，利用分子对接软件MOLOC和GNINA对设计的化合物进行虚拟筛选和结合模式预测。合成方面，采用Ugi-四唑多组分反应（UT-4CRs）高效构建目标化合物库，通过可裂解的异腈、叠氮三甲基硅烷、醛和仲胺四组分一锅法反应获得目标骨架。生物学评价方面，使用荧光底物YVAD-AFC评价化合物对caspase-1的抑制活性；采用MTT法检测化合物6e在小鼠C2C12成肌细胞中的细胞毒性。分子动力学模拟使用OpenMM引擎结合AMBER ff14SB和OpenFF 2.1.1力场进行200 ns的模拟分析。初步体内研究使用C57BL/10ScSn-DMDmdx/J（mdx）杜氏肌营养不良小鼠模型，对照组为C57BL/10ScSnJ健康小鼠，化合物6e以1 mg/kg腹腔注射，每周三次，持续两周，采用握力测试评价肌肉力量。
主要研究结果：
2.1 设计：研究人员分析了caspase-1的晶体结构（PDB ID 2HBQ），将底物结合位点划分为三个主要区域：包含催化Cys285的活性位点、浅的S2口袋和深的疏水沟槽。通过分子模拟，研究人员发现1H-四唑负离子能与催化位点的Arg179和Arg341形成电荷-电荷相互作用和三叉状氢键网络，与羧酸根相比具有类似的结合特征，验证了四唑作为羧酸生物电子等排体的可行性。基于此，研究人员设计了一系列5-取代1H-四唑骨架化合物，其中四唑部分占据P1亚位点模拟天冬氨酸，R1取代基延伸至S1'口袋，R2取代基占据S2口袋，R3取代基延伸至深的疏水沟槽，与Trp340、Pro343和His342形成相互作用。
2.2 合成：研究人员采用UT-4CRs合成了目标化合物，通过仲胺1a-g、乙醛酸乙酯2、异腈3和三甲基硅基叠氮4在甲醇中室温反应24-48小时得到Ugi产物5a-g，随后经LiOH水解去保护得到目标化合物6a-g。对于需要修饰R2取代基的仲胺1b-g，研究人员通过2-氯-N-(4-苯氧基苯基)乙酰胺7与相应的伯胺8b-g在K?CO?存在下于DMF中60°C反应过夜制备。共合成7个目标化合物，所有化合物均通过1H NMR、13C NMR、质谱和元素分析进行了结构表征。
2.3 生物学活性评价：体外caspase-1抑制活性测定采用荧光底物YVAD-AFC法。化合物6b-f在测试浓度范围内表现出剂量依赖性抑制活性，IC??值范围为0.36-2.36 μM。其中，含环戊基取代的化合物6e和含苄基取代的化合物6f活性最高，IC??值分别为380 nM和360 nM，而含丁基、环丙基和环丁基的化合物活性较低，IC??值分别为0.86、1.49和2.36 μM。化合物6a和6g在最高测试浓度100 μM时未表现出活性。与先前报道的1,5-二取代α-氨基四唑系列相比，化合物6e和6f的酶学活性提高了约30倍。
初步体内研究：在mdx小鼠模型中，化合物6e（1 mg/kg腹腔注射，每周三次，持续两周）治疗组显示出肌肉力量改善的趋势。细胞毒性评价方面，MTT法检测显示化合物6e在C2C12肌细胞中未观察到明显毒性。
2.4 分子动力学研究：研究人员对化合物6e的两种对映异构体在caspase-1活性位点中的结合模式进行了200 ns的分子动力学模拟。晶体配体WEO（PDB 5MMV）作为非共价参考化合物。RMSD分析表明S-6e对映异构体在口袋中的稳定性优于R-6e，R-6e因联苯醚部分重新定位失去与S4亚口袋的接触而表现出较差的稳定性。RMSF分析显示WEO和6e系统之间的整体蛋白质动力学无明显差异。极性接触分析表明，S-6e通过Gly238和Cys285的持久氢键在碱性口袋中稳定结合，而R-6e虽与精氨酸有接触但为次优模式。半径回转分析进一步证实两种体系蛋白的整体致密性相似。
讨论与结论：本研究通过基于结构的药物设计和多组分反应化学，成功开发了一类结构新颖的5-取代1H-四唑类caspase-1非共价抑制剂。1H-四唑作为羧酸生物电子等排体的策略被证实有效，化合物6e和6f的IC??值分别达到380和360 nM，较先前报道的α-氨基四唑系列提高了约30倍。初步体内研究显示化合物6e在mdx小鼠中具有改善肌肉功能的趋势且无细胞毒性。分子动力学模拟揭示了4S-6e与R-6e对映异构体的不同结合行为和构象偏好，提示立体化学优化可能成为进一步提高活性的重要方向。该研究为开发结构新颖的caspase-1非共价抑制剂提供了新的骨架起点，未来研究将聚焦于类似物库的构建以提高活性、表征对相关caspase和半胱氨酸蛋白酶的选择性、研究立体化学对生物活性的影响，以及评估细胞和药代动力学性质以支持进一步的临床前开发。
研究结论：本研究报道了一类结构新颖的5-取代1H-四唑类caspase-1抑制剂的设计、合成和生物学评价。基于结构的药物设计策略结合多组分反应化学，研究人员鉴定出了具有中等纳摩尔至低微摩尔IC??值的强效抑制剂，其中化合物6e和6f活性最佳（IC??分别为380 nM和360 nM）。与先前报道的1,5-二取代α-氨基四唑系列相比，化合物6e和6f的酶学活性提高了约30倍，支持1H-四唑作为羧酸生物电子等排体用于开发结构新颖、不含亲电弹头（避免共价修饰催化半胱氨酸）的caspase-1抑制剂骨架。初步体内研究显示，化合物6e在肌营养不良小鼠模型中具有改善肌肉协调性和力量的趋势，且在小鼠肌细胞中未观察到毒性。分子动力学模拟提示化合物6e的两种对映异构体在caspase-1结合口袋中具有不同的结合行为、构象偏好和相互作用模式，为未来优化提供了见解。立体化学对生物活性的贡献、详细的抑制机制和选择性谱仍需进一步表征。总体而言，该工作为caspase-1抑制提供了一个结构新颖的含1H-四唑骨架，为后续优化提供了有前景的起点。
