近摩尔浓度下三磷酸腺苷的结构与动力学特性

《Biophysical Chemistry》：Structure and dynamics of adenosine triphosphate at near-molar concentrations

　　

摘要
三磷酸腺苷 (ATP) 可在特定的生物隔室内积累至近摩尔浓度，从而影响多种细胞过程。然而，在这些拥挤条件下，其结构组织和分子动力学仍知之甚少。在本研究中，制备并研究了含有近摩尔浓度 ATP 的 ATP 凝胶体系，使用了固态核磁共振 (ssNMR) 光谱学和全原子分子动力学 (MD) 模拟。ssNMR 结果显示，ATP 发生自发水解，生成二磷酸腺苷 (ADP) 和无机磷酸盐 (Pi)。结合的 ssNMR 和 MD 分析进一步表明，ATP/ADP 分子存在局部的嘌呤堆叠和离子介导的“尾对尾”排列，其中阳离子簇吸引阴离子磷酸基团并限制末端磷酸基团的运动。ATP β-磷酸信号的抑制归因于空间位阻和有限的溶剂可及性导致的含水量降低。ATP-HCl 和 ATP-HAc 凝胶的比较表明，ATP 水解水平和分子动力学都受到阴离子种类的强烈调节。MD 模拟进一步揭示，ATP-HCl 凝胶中 Mg2+ 介导的分子间桥接略有增加，局部质量密度也略高。这些结果提供了分子水平上对高浓度下 ATP 行为的见解，并突出了阴离子种类在调节 ATP 稳定性和组织方面的关键作用。

引言
三磷酸腺苷 (ATP) 是一种普遍存在的核苷酸，被公认为是生物系统主要的“能量货币”。在结构上，ATP 由连接到核糖部分的腺嘌呤碱基组成，后者与一条由三个磷酸基团组成的线性链发生酯化。在典型的生理条件下，细胞内 ATP 浓度维持在毫摩尔范围内（约 1–10 mM），这一范围在生物化学和生物物理学方面已被广泛表征 [1], [2]。然而，越来越多的证据表明，ATP 可以在特定的细胞环境中达到高得多的近摩尔浓度。在这些条件下，ATP 表现出与稀溶液中观察到的截然不同的物理化学行为和生物功能。这种浓度依赖性属性表明，当 ATP 局部浓度异常高时，它可能具有超越磷酸基团转移的功能角色。

据报道，在专门的细胞器内，ATP 和其他核苷酸具有惊人的高浓度。突出的例子包括肾上腺髓质中的嗜铬细胞颗粒和血小板中的致密颗粒，其中 ATP 浓度接近或超过亚摩尔范围 [3]。定量分析显示，ATP 在牛肾上腺嗜铬细胞颗粒中达到约 0.14 M，在哺乳动物血小板含有 5-羟色胺的细胞器中高达 0.64 M [3]。尽管这些细胞器存在于不同的细胞类型中，但两者都作为生物活性分子的储存室，在生理刺激的响应下以严格调控的方式释放。

嗜铬细胞颗粒是存在于肾上腺髓质神经内分泌嗜铬细胞中的大型致密核心囊泡。这些囊泡在应对压力时将肾上腺素和去甲肾上腺素分泌到全身循环中 [4], [5]。为了克服儿茶酚胺在异常高浓度（0.8–1.0 M）下积累带来的静电和渗透挑战，ATP 以同样高的水平共储存。通过与质子化的儿茶酚胺发生静电结合，ATP 有效地降低了渗透压并稳定了囊泡腔内胺的紧密堆积，从而使其能够显著积累 [5], [6]。在外排释放时，嗜铬细胞颗粒以毫摩尔的量级与儿茶酚胺一起释放 ATP。虽然循环中的肾上腺素和去甲肾上腺素作用于远处的靶组织以协调全身压力反应，但 ATP 作为信号分子在局部和系统层面发挥作用，激活多种组织中的嘌呤能受体。此外，ATP 与去甲肾上腺素在交感神经末梢共同释放，强调了其作为共递质的作用。总之，ATP 在神经内分泌压力轴中作为关键的辅因子和共信使 [7]。

ATP 在血小板生理中也起着关键作用。在感知血管损伤或促炎信号后，血小板发生激活并释放其细胞内颗粒的内容物，启动血小板聚集并调节局部血管环境。致密颗粒使高度浓缩的 ATP 和二磷酸腺苷 (ADP) 以及其他小分子介导者能够迅速分泌，以协调止血、血栓形成和免疫反应。释放后，细胞外 ATP 和 ADP 作为强效信号分子，与血小板和周围细胞上的嘌呤能受体结合，从而放大血小板的募集和激活 [8]。这些观察结果强调了 ATP 在局部高浓度下在压力反应、凝血和细胞间通讯中的重要性。

尽管 ATP 具有核心的生物作用，但近摩尔浓度下 ATP 的结构组织和动态行为仍知之甚少。Tang 等人最近的工作发现，浓缩的 ATP 可以发生二价阳离子依赖的相分离，其中 Mg2+ 促进水合 ATP 纳米簇的形成，进而渗透形成粘弹性凝胶状凝聚物，而 Ca2+ 驱动 ATP 形成固体状沉淀 [9]。他们发现 ATP 凝聚过程是通过化学计量纳米簇中间体进行的，而不是简单的静电中和。尽管 ATP 在几类分泌颗粒中高度浓缩，但其天然物质状态仍未完全解决，并可能在细胞器之间有所不同。因此，此处研究的 ATP-HCl 和 ATP-HAc 凝胶被视为浓缩 Mg2+-ATP 组装体的简化体外模型，而不是天然颗粒的精确复制品。然而，此类重构 ATP 凝胶的局部分子结构、水合环境、抗衡离子调节和内部动力学仍未得到充分解决。这些特征预计将与稀 ATP 溶液有显著差异，特别是因为高 ATP 浓度可以改变质子化平衡、离子对、水组织和核苷酸堆积 [8], [10]。因此，理解这些浓度依赖性属性对于解释富含 ATP、拥挤或空间受限的生物环境很重要，包括血小板致密颗粒、神经元突触、收缩肌肉和肿瘤微环境，在这些环境中 ATP 被浓缩、释放、消耗或动态调节。

此外，ATP 与其水解产物二磷酸腺苷 (ADP) 和无机磷酸盐 (Pi) 存在平衡。因此，对高浓度 ATP 的研究必须考虑这种耦合化学系统，而不是将 ATP 视为孤立物种。因为 ATP 在生理条件下主要作为多阴离子存在，通常与 Mg2+ 和/或质子形成复合物，伴随抗衡离子的作用可能被低估了 [11]。

富含 ATP 的分泌室是化学复杂、酸性且高离子浓度的环境，其中 ATP 与 Mg2+、质子、水和周围抗衡离子共存。ATP 在几类分泌囊泡中以特别高的浓度储存，其中与其他溶质的结合有助于囊泡的组织和功能 [12]。值得注意的是，囊泡内 ATP 的积累由囊泡核苷酸转运蛋白 VNUT/SLC17A9 介导，其 ATP 转运活性是氯离子依赖性的，提供了阴离子组成与 ATP 储存之间的直接生物学联系 [13]。在近摩尔 ATP 浓度下，抗衡离子化学的差异可能影响 Mg2+ 配位、质子化平衡、水合、静电屏蔽和核苷酸自缔合 [14]。因此，选择氯离子作为具有生物学相关性的无机阴离子，而使用乙酸根作为化学上不同的模型羧酸根阴离子，以确定周围阴离子环境是否调节浓缩 Mg2+-ATP 组装体的稳定性和组织。

在本研究中，采用固态核磁共振 (ssNMR) 光谱学来研究近摩尔浓度条件下 ATP 水解和结构信息。ssNMR 提供了关于局部化学环境、分子运动性和分子间相互作用的位点特异性信息，提供了使用传统溶液态技术无法获得的见解 [15], [16]。补充的全原子分子动力学 (MD) 模拟通过解析凝胶网络内 ATP/ADP/Pi 的组织、Mg2+ 介导的分子间桥接、水合模式和阴离子依赖性堆积，为 ssNMR 观察提供分子水平的结构背景。通过结合高分辨率光谱分析和 MD 模拟以及具有生物学动机的简化高浓度 ATP 模型，本研究旨在阐明近摩尔浓度下 ATP 行为的分子基础，定义不同阴离子种类在这个复杂系统中的作用，并阐明这种高浓度 ATP 状态在生理相关环境中的功能意义。

章节片段
ATP 凝胶样品制备
所有化学试剂均按原样使用，未进行进一步纯化。为了制备 ATP-HAc 样品，通过将 5.5114 g 三磷酸腺苷二钠盐 (Na2ATP, 0.01 mol; Macklin, 99%) 溶解在去离子 (DI) 水中，制备 1.0 mol L?1 Na3HATP 溶液。使用乙酸 (HAc; Sigma-Aldrich, ≥ 99.99%) 和氢氧化钠 (NaOH; Merck, ACS 试剂级) 将 pH 调节至 5.4，并将溶液体积调节至 10 mL。
A 4.0 mol L?1 醋酸镁溶液

结果与讨论
为了研究高浓度 ATP 的性质，制备了 ATP-HCl 凝胶。如图 S2 所示，获得了粘弹性凝胶相，这与之前的报道一致 [9]。最初使用单脉冲 31P 固态核磁共振光谱学检查该凝胶。如图 1(a) 所示，可以清楚地分辨出多种含磷物种。位于 ?0.11 和 ?0.48 ppm 处的峰被归属为无机磷酸盐 (Pi)，而位于 ?8.06, ?8.50, ?10.80, ?11.63 处的信号，

结论
在本工作中，制备并研究了含有近摩尔 ATP 浓度的 ATP 凝胶体系，使用了固态核磁共振光谱学结合全原子 MD 模拟。ATP-HCl 凝胶的 31P 单脉冲 NMR 光谱显示，在实验条件下 ATP 发生自发水解，生成 ADP 和无机磷酸盐 (Pi)。二维 31P-31P PDSD 进一步显示 Pi 与 ATP/ADP 磷酸链之间的空间邻近性，表明纳米尺度

基金致谢
K.X. 感谢南洋理工大学为南洋理工大学高场核磁共振光谱学与成像中心提供的大学资金、启动基金 (SUG) 以及新加坡教育部 (MOE) 在其学术研究基金一级 (RS02/25, RG180/25) 下的资金支持。C.H. 感谢新加坡教育部 (MOE) 在其学术研究基金一级 (RG84/25) 下的资金支持。

CRediT 作者贡献声明
罗松竹：写作 – 审查与编辑，写作 – 原稿，方法论，形式分析，数据整理。李孜涵：写作 – 审查与编辑，方法论，概念化。张俊鹏：写作 – 审查与编辑，方法论，形式分析，数据整理。黄长春：写作 – 审查与编辑，监督，资金获取。唐春：写作 – 审查与编辑，监督，资金获取，形式分析，概念化。薛凯：写作 – 审查与编辑，

利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，可能会影响本文中报告的工作。

罗松竹|李孜涵|张俊鹏|黄长春|唐春|薛凯
南洋理工大学高场核磁共振光谱学与成像中心，新加坡南苑道 21 号，新加坡 637371，新加坡