功能化MOFs的界面微环境工程：用于固定PET水解酶ICCG，以克服高效PET降解过程中的活性-稳定性trade-off问题

《Bioresource Technology》：Interfacial microenvironment engineering of functionalized MOFs for immobilizing PET hydrolase ICCG to overcome the activity–stability trade–off in efficient PET depolymerization

　　•ICCG通过微环境调节固定在功能化的Zr-MOFs上。•与游离酶相比，PET的TPA产率翻倍，同时具有更好的热/pH稳定性。•模拟显示了酶与MOF之间的强烈相互作用，从而提高了性能。•优异的可重复使用性和耐溶剂性使得实际生物催化回收成为可能。

引言
随着现代社会的快速发展，塑料的过度使用带来了持续的废物管理挑战。不可降解的聚合物如聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）可能在环境中存在数百年，或者在焚烧时释放有毒化合物，而可降解的替代品如聚对苯二甲酸丁酸丁二醇酯（PBAT）则需要特定的条件才能分解。因此，塑料污染仍然普遍存在，迫切需要解决方案（Kumar等人，2023年；Sahith等人，2025年；Yao等人，2024年）。传统的处理方法包括热裂解和填埋，往往效率低下、能耗高且对环境有害（Sahith等人，2025年）。化学方法不可避免地会产生复杂的杂质混合物，这些杂质难以去除，增加了技术和经济上的障碍。在这种情况下，酶促降解作为一种吸引人的绿色替代方案出现，因为它在温和的水性条件下运行，并符合可持续化学的原则（Ma等人，2025年）。生物催化降解在效率和环境兼容性方面具有显著优势（López-Teijeiro等人，2025年）。
来自植物和病原微生物的角质酶被归类为α/β-水解酶超家族，最初因其能够水解角质中的酯键而被发现（Chen等人，2013年）。其中，叶枝堆肥角质酶（LCC）变体ICCG表现出出色的催化性能：在72°C下10小时内可以降解90%的非晶态或预处理的PET，生成对苯二甲酸（TPA）单体（Tournier等人，2020年）。据报道，LCC的水解速率至少是其他PET水解酶（例如ISPETase、FsC）的33倍（Tournier等人，2020年），其高熔点（Tm = 84.7°C）反映了其显著的热稳定性。实际上，ICCG是已知最耐热的PET水解酶之一。水解产物包括双(2-羟乙基)对苯二甲酸（BHET）、单(2-羟乙基)对苯二甲酸（MHET）、TPA和乙二醇（EG），可以直接用于闭环PET再生，由此产生的生物回收PET的性能与通过石化路线获得的PET相当（Su等人，2026年）。这些特性使ICCG成为工业PET回收的高潜力生物催化剂。然而，其实际应用仍受到操作稳定性和回收困难的限制，这突显了有效酶固定的必要性（Jia等人，2021年）。
将酶固定在固体载体上是一种提高稳定性、实现重复使用并改进整体工艺效率的强大手段。与游离酶相比，固定化的酶通常对恶劣条件具有更强的抵抗力、更好的热耐受性以及更易于分离，从而降低成本并支持可持续实施（Awad和Mohamed，2019年）。已经探索了多种载体用于PET水解酶的固定，包括无机材料（Jia等人，2021年；Romano等人，2023年；Zhou等人，2024年）、有机聚合物/树脂（Pazol等人，2019年；Won等人，2022年；Zhang等人，2025年）以及混合多孔系统（Tong等人，2025年；Wang等人，2026年）。例如，PETaseS238F/W159H被锚定在组氨酸标记的功能化Fe3O4纳米粒子上，提高了耐用性并便于磁回收（Schwaminger等人，2021年）。在另一个例子中，使用衍生自ZIF-67的FeCoLDH固定ICCG，并进一步用单宁酸和海藻酸钠修饰，得到了具有增强pH耐受性、热稳定性和可重复使用性的复合材料（Chen等人，2025b）。然而，这样的载体常常具有表面功能不足或可定制性有限的问题，这限制了酶的加载量和活性保持（Paul等人，2025年）。
金属有机框架（MOFs）由于其高表面积、化学多样性和结构稳定性而成为有吸引力的固定基质（Du等人，2022年；Wang等人，2020年）。MOFs由金属节点与多功能有机连接剂配位形成，提供了明确的表面化学环境，有助于促进底物接近和酶-底物相互作用。然而，鉴于许多Zr-MOFs的典型微孔性质（通常小于2 nm）（Feng等人，2020年）和ICCG的较大分子量（约28 kDa）（Gao等人，2024年），可以合理推断酶主要固定在表面而非孔道内。因此，在该系统中，MOFs的表面化学性质而非空间限制起着关键作用。迄今为止，MOFs已被广泛用于固定各种酶（Feng等人，2024年；Patil等人，2025a；Xia等人，2020年），但关于它们用于PET水解酶的报道仍然很少。Qin等人设计了一种疏水蛋白HFBI与PETase和MHETase融合体，将其固定在CaZn-MOF上，构建了一个自组装的协同生物催化剂（MC@CaZn-MOF），在120小时后仍保留了超过70%的活性，并显示出更好的稳定性（Zhang等人，2024年）。在另一项研究中，Wang及其同事构建了一个双酶全细胞催化剂（PM），然后将其固定在CaZn-MOF上（Chang等人，2026年）。结果表明，PM@CaZn-MOF系统的活性提高了65%，同时保持了95%的自由酶的催化效率，良好的可重复使用性——经过五次循环后仍保持超过80%的活性，并连续运行超过160小时。总体而言，这些研究表明MOFs在固定PET水解酶方面具有巨大潜力，但该领域的研究仍处于初级阶段。这一空白强调了进一步探索基于MOF的平台以实现高性能PET水解的必要性。
常见的酶固定在MOFs上的方法包括共价键合、物理吸附和共沉淀（Chen等人，2025a；Guo等人，2025年）。固定在MOFs上可以解决游离酶操作稳定性差和回收困难的问题；然而，由于酶移动性受限，固定的酶往往在活性和稳定性之间存在权衡（Weltz等人，2020年；Yang等人，2023年）。这种权衡源于酶与载体的多点连接，这使酶结构变得僵硬并增强了稳定性，但同时也限制了对催化至关重要的构象动态（Weltz等人，2020b）。已经开发了各种策略来缓解这一问题，如缺陷工程（Patil等人，2025b）、柔性连接剂（Wu等人，2018年）和定向进化（Nezhad等人，2023年），但每种方法都有其局限性。用特定基团功能化MOFs可以与酶表面产生互补作用，从而在不过度限制其动态行为的情况下稳定酶，为克服活性-稳定性权衡提供了有希望的途径（Tang等人，2025年）。物理吸附特别简单，可以保持酶的构象并且没有严格的尺寸限制。然而，由于涉及的相互作用较弱，酶容易从载体上渗出（Wang等人，2020年）。最近的研究表明，用特定基团功能化MOFs可以与酶表面产生互补作用，从而提高负载能力同时保持催化活性（Yang等人，2024年）。同时，引入有机功能基团可以调节MOF表面的界面微环境，提高其生物相容性，并创造一个更有利于酶的环境，从而有助于克服活性-稳定性权衡。
在这项工作中，我们通过设计一系列基于锆的MOFs（Zr-MOFs：ZrBTB、ZrBTB-NH2、ZrBTB-CH3、ZrBTB-Py和ZrBTB-NHAc，图S1）作为ICCG固定的定制载体，解决了现有载体的局限性。选择Zr-MOFs是因为它们具有出色的化学和热稳定性（Wang等人，2025年）。ICCG通过物理吸附固定在表面，所得到的生物复合材料系统地评估了酶的加载量、催化活性、动力学参数、环境耐受性、储存稳定性和可重复使用性。优化的生物催化剂（ICCG@ZrBTB-NH2）被用于PET、PBT和PBAT的酶促降解，表现出优异的性能。值得注意的是，在72°C下70小时后，它产生的对苯二甲酸（TPA）量是游离ICCG的两倍多。分子对接和分子动力学模拟阐明了酶-MOF之间的相互作用，揭示了功能团如何增强结合亲和力、提高稳定性并帮助保持酶的天然构象。这种设计策略有效规避了固定酶常见的活性-稳定性权衡。总体而言，这项研究不仅提供了一个高效的PET降解固定酶系统，还为塑料废物利用的先进生物催化剂平台的设计提供了机制性见解。

材料制备和固定
ICCG被表达和纯化，ZrBTB系列MOFs根据文献方法合成（Xie等人，2022年），并确定了ICCG@MOFs复合材料的蛋白质加载量。详细程序见支持信息。

酶活性测定
作为角质酶之一，ICCG可以通过切割其酯键来催化p-硝基苯基丁酸（pNPB）的水解，释放p-硝基苯酚（pNP）。通过测定吸光度来评估角质酶的活性。

蛋白质纯化
据报道，工程化的LCC四倍突变体ICCG是效率最高的塑料降解酶。在这项工作中，成功构建了一个在N端带有短His标签的ICCG-pCold II载体，以方便酶的纯化。首先使用镍柱捕获重组ICCG蛋白，然后根据ICCG的等电点使用阳离子柱进行进一步纯化。如SDS-PAGE图S1所示，纯化的条带更加明显。

结论
总之，本研究通过将耐热的角质酶ICCG固定在一系列定制的Zr-MOFs上，成功开发了一个强大且高效的PET酶促降解生物催化系统。在测试的载体中，胺功能化的ZrBTB-NH2框架成为最佳载体，产生了ICCG@ZrBTB-NH2生物复合材料。这种固定的酶在温度和pH的挑战性条件下显示出显著增强的操作稳定性。

作者贡献声明
Xinyu Liu：撰写——原始草稿、验证、方法学、调查、正式分析、数据管理。
Zhong Wang：资源、数据管理。
Xuan Jing：调查、正式分析、数据管理。
Xiaomin Hou：撰写——审查与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取、概念化。
Si-Fu Tang：撰写——审查与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取。

利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号32170172）和山东省自然科学基金（ZR2024MC111、ZR2024MB048）的支持。

Xinyu Liu | Zhong Wang | Xuan Jing | Xiaomin Hou | Si-Fu Tang