PEDV包膜蛋白通过TRIM28-KLF15-FPN轴重塑宿主铁稳态以促进病毒复制

《Journal of Virology》：PEDV envelope protein promotes viral replication by remodeling host iron homeostasis via the TRIM28-KLF15-FPN axis

　　

摘要
猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于甲型冠状病毒属，可引起严重肠道疾病，在哺乳仔猪中死亡率高达100%。铁是包括病毒在内的多种病原体复制所必需的微量营养素，病原体通过劫持宿主铁资源以支持其增殖。SLC40A1编码膜铁转运蛋白（ferroportin，FPN），是哺乳动物中已知唯一铁输出蛋白，也是病原体操纵宿主铁稳态的关键靶点。然而，冠状病毒是否利用该机制尚不清楚。本研究表明，PEDV感染通过KLF15-FPN调控轴破坏宿主铁稳态，导致FPN表达受抑、细胞内铁蓄积及病毒复制增强。机制上，PEDV包膜（envelope，E）蛋白通过其PDZ结合基序（PDZ-binding motif，PBM）诱导Krüppel样因子15（Krüppel-like factor 15，KLF15）发生细胞质聚集，促进含三联基序蛋白28（tripartite motif-containing protein 28，TRIM28）依赖的KLF15第339位赖氨酸（K339）K63连接泛素化及自噬-溶酶体途径降解，从而抑制KLF15介导的SLC40A1转录激活。研究人员的研究揭示了一种新的铁劫持策略，即PEDV通过KLF15-FPN调控轴重塑宿主铁稳态，为冠状病毒-宿主相互作用及潜在抗病毒干预策略提供了新见解。

**论文解读：PEDV包膜蛋白通过TRIM28-KLF15-FPN轴重塑宿主铁稳态促进病毒复制的机制研究**

**一、研究背景与研究意义**

冠状病毒（coronaviruses，CoVs）是重要的人畜共患病原体，分为甲型、乙型、丙型及丁型冠状病毒四个属。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于甲型冠状病毒，其基因组为约28 kb的单股正链RNA，编码16个非结构蛋白（nsp1–nsp16）、4个结构蛋白〔刺突（spike，S）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白、膜（membrane，M）蛋白和核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白〕及1个辅助蛋白ORF3。PEDV引起猪流行性腹泻，以呕吐、水样腹泻和脱水为特征，哺乳仔猪死亡率高达100%。自20世纪70年代在英国首次报道以来，PEDV已在全球广泛传播，2010年出现的高毒力变异株更造成了严重经济损失。然而，现有疫苗对流行变异株的保护效果有限，亟需深入了解PEDV的致病分子机制。

铁是细胞代谢中不可或缺的微量元素，参与多种酶促反应、核酸合成及线粒体能量代谢，同时也是病毒复制的重要辅助因子。许多病毒通过劫持宿主铁代谢，创造有利于自身生命周期完成的环境。宿主细胞铁稳态的维持依赖于铁摄取、储存、利用、转运和外排的协同调控，其中由SLC40A1编码的膜铁转运蛋白（ferroportin，FPN）是哺乳动物中已知唯一的铁输出蛋白，其在调节细胞内不稳定铁池中发挥关键作用。已有研究表明，单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus type 1，HSV-1）、水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）和仙台病毒（Sendai virus，SeV）可通过DTX3L介导的K48连接泛素化促进FPN降解，导致细胞内铁蓄积而增强病毒复制。然而，冠状病毒尤其是PEDV是否利用以FPN为中心的铁外排通路来获取宿主铁，此前尚不清楚。因此，阐明PEDV调控宿主铁稳态的分子机制，对深入理解冠状病毒-宿主互作及开发新型抗病毒策略具有重要意义。

**二、主要技术方法**

研究人员采用多学科技术手段开展研究。首先使用猪肠上皮细胞系IPEC-J2和LLC-PK1细胞进行PEDV感染实验，并通过全转录组测序筛选差异表达基因。动物实验方面，选用3日龄SPF仔猪进行PEDV攻毒实验。研究涉及的关键技术包括：Western blotting和qRT-PCR检测基因表达水平、50%组织培养感染剂量（TCID50）测定病毒滴度、免疫荧光共聚焦显微镜观察蛋白定位、双荧光素酶报告基因实验鉴定启动子活性、染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）验证转录因子结合、免疫沉淀联合质谱（IP-MS）筛选互作蛋白、Co-IP验证蛋白相互作用，以及核质分离实验分析蛋白亚细胞定位。此外还构建了多种突变体和基因敲低/过表达模型进行功能验证。

**三、研究结果**

（一）PEDV在体内外均下调FPN表达
为了鉴定潜在的宿主抗病毒因子，研究人员对PEDV感染的IPEC-J2细胞进行全转录组测序，发现SLC40A1是下调最显著的基因。在IPEC-J2和LLC-PK1细胞中验证了PEDV感染抑制FPN表达。体内实验中，3日龄仔猪经口感染PEDV后，十二指肠、空肠和回肠中FPN表达显著下调，同时肠道组织铁水平明显升高而血清铁水平显著下降。此外，PEDV感染还增加了铁蛋白重链（FTH1）表达，而二价金属转运蛋白1（DMT1）的表达不受影响。

（二）FPN通过降低细胞铁可用性抑制PEDV复制
在IPEC-J2细胞中过表达Flag-FPN可显著降低细胞内Fe²⁺水平并抑制PEDV复制，而补充枸橼酸铁铵（ferric ammonium citrate，FAC）可逆转这一效应。相反，敲低FPN表达则增加Fe²⁺水平并促进PEDV增殖，而铁螯合剂Dp44mT处理可消除该效应。值得注意的是，FAC单独处理可上调FTH1和SLC40A1/FPN表达，但PEDV感染显著削弱了FAC诱导的FPN表达上调，提示PEDV在铁过载条件下优先破坏FPN介导的铁外排反应。

（三）KLF15直接激活SLC40A1转录且受PEDV感染抑制
通过构建SLC40A1启动子系列截短报告基因载体，鉴定出核心启动子区域位于?700至?1。JASPAR数据库预测及荧光素酶报告实验验证显示，Krüppel样因子15（KLF15）可显著激活FPN启动子活性。将KLF15核心结合序列C(G/T)CCCC突变为CAATCC后，启动子活性显著降低。ChIP-qPCR实验证实KLF15富集于内源性SLC40A1启动子区域。过表达KLF15上调FPN表达，敲低KLF15则抑制FPN表达。PEDV感染显著降低KLF15蛋白水平而不影响其mRNA水平，过表达KLF15可缓解PEDV诱导的FPN表达抑制。

（四）PEDV与KLF15互作并促进其细胞质蓄积
野生型和紫外线灭活的PEDV均能降低FPN mRNA水平和KLF15蛋白表达，表明该效应不依赖病毒复制。筛选PEDV四种结构蛋白发现，E蛋白对KLF15和FPN表达的抑制作用最为显著。Co-IP实验证实PEDV E蛋白与内源性及外源性KLF15均存在相互作用。免疫荧光和核质分离实验表明，PEDV E蛋白诱导KLF15从细胞核向细胞质重新分布。将E蛋白C端PDZ结合基序（PDZ-binding motif，PBM）突变为丙氨酸后，其抑制KLF15/FPN表达和升高细胞内Fe²⁺水平的能力显著降低，证明PBM对PEDV E蛋白调控KLF15-FPN-铁通路至关重要。

（五）PEDV E蛋白促进KLF15的K63连接泛素化及降解
溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine phosphate，CQ）可抑制PEDV E诱导的KLF15降解，而蛋白酶体抑制剂MG132无此效应；自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin，RAPA）则增强该降解过程，表明PEDV E通过自噬-溶酶体途径降解KLF15。泛素化分析显示，PEDV E优先介导KLF15的K63连接多聚泛素化而非K48连接。将KLF15第339位赖氨酸突变为精氨酸（K339R）后，PEDV E诱导的K63连接泛素化被消除，KLF15降解减弱并更多保留于细胞核，且K339R突变体在PEDV E表达条件下对FPN表达的促进作用更强，表明K339是PEDV E介导FPN下调所需的关键位点。

（六）TRIM28促进PEDV E诱导的KLF15泛素化与降解
通过免疫沉淀-质谱分析，鉴定出三联基序蛋白28（tripartite motif-containing protein 28，TRIM28）为PEDV E的互作蛋白，Co-IP实验确认了二者的相互作用。TRIM28敲低对KLF15的K48连接泛素化影响甚微，但显著降低K63连接泛素化；TRIM28过表达则增强上述效应。TRIM28敲低可减轻PEDV E介导的FPN转录和蛋白水平抑制。删除TRIM28的RING结构域（?Ring）后，其去稳定化KLF15的能力丧失，FPN表达得以恢复。此外，TRIM28敲低恢复了PEDV感染条件下的KLF15和FPN表达，降低细胞内铁水平并抑制PEDV复制；共敲低KLF15或FPN则分别消除TRIM28敲低对FPN表达及铁水平和病毒复制的调节作用，证明TRIM28是KLF15-FPN-铁轴的上游调控因子。

**四、讨论与结论**

铁代谢与病毒复制密切相关。本研究揭示了PEDV E蛋白的一种新功能，即通过招募E3泛素连接酶TRIM28降解宿主转录因子KLF15，从而重塑宿主铁稳态以促进病毒复制。机制上，PEDV E蛋白的PBM基序诱导KLF15从细胞核向细胞质转运并发生细胞质聚集，随后TRIM28介导KLF15 K339位点的K63连接泛素化，经自噬-溶酶体途径降解，进而抑制KLF15对SLC40A1的转录激活，最终导致FPN表达下调、细胞内铁蓄积和病毒复制增强。体内实验显示，PEDV感染新生仔猪引起肠道铁蓄积和血清铁降低，提示感染相关的铁在组织和循环之间的再分布。

研究结果建立了冠状病毒感染与宿主铁稳态重塑之间的机制联系，丰富了人们对PEDV致病机制的认识。KLF15作为FPN表达的新型转录调控因子，TRIM28-KLF15-FPN轴有望成为抗冠状病毒干预的潜在靶点。然而，研究人员也指出，细胞内铁代谢涉及铁摄取、储存、利用等多条相互关联的通路，其他铁代谢调控因子如转铁蛋白受体1和铁蛋白在本研究中未被全面表征，PEDV是否调节这些额外的铁代谢通路仍有待探索。关于基于全身性铁耗竭的抗病毒策略的潜在风险、特异性、安全性及体内有效性，仍需进一步研究。

综上所述，该研究揭示了PEDV通过TRIM28-KLF15-FPN调控轴破坏宿主铁稳态的新机制：PEDV E蛋白促进TRIM28介导的KLF15泛素化和降解，导致SLC40A1/FPN表达降低、细胞内铁潴留和病毒复制增强，为理解冠状病毒-宿主互作及开发靶向宿主铁调控的抗冠状病毒策略提供了新的理论基础。