嗜盐性果胶聚糖基生物材料在烧伤治疗中伤口愈合效果的体内评估

《Burns》：in vivo Evaluation of Wound Healing Efficacy of Halophilic Levan-Based Biomaterial in the Treatment of Burns

　　

摘要严重烧伤的特征不仅是组织破坏，还包括炎症反应失调、细胞因子过度释放以及细胞外基质（ECM）重塑受损。持续的 TNF-α 信号传导和延长的炎症激活导致再上皮化延迟和胶原蛋白排列异常，最终导致纤维化和瘢痕形成。因此，能够调节早期炎症级联反应同时支持血管生成和 ECM 成熟的生物材料代表了高级烧伤护理中关键未满足的需求。在本研究中，开发了含有由 *Halomonas elongata* 153 R 产生的嗜盐果聚糖的生物活性凝胶，并在标准化的二度烧伤模型中进行了评估。果聚糖（5%–20% w/w）被纳入聚乙烯醇/黄原胶/卡波姆基质中，以获得临床适用的凝胶配方。在人真皮成纤维细胞中确认了细胞相容性。在斯普雷格 - 戴维大鼠（n = 140）的第 3 天和第 14 天，通过宏观、组织病理学、免疫组织化学和基因表达分析评估了体内治疗功效。局部应用 10% 和 15% 果聚糖水凝胶与未处理对照组相比加速了伤口闭合，并显示出改善的再上皮化、更具条理且以 I 型为主的胶原蛋白沉积以及增加的新生血管化。第 14 天 TNF-α 表达显著调节，表明炎症进程更为有序。总体而言，基于果聚糖的凝胶在该实验模型中对烧伤伤口修复的关键参数显示出有利影响，可能需要进一步调查作为烧伤局部管理的辅助材料。

引言伤口可根据受影响组织的深度（浅表 - 全层）、其发展和愈合过程（急性 - 慢性）、病因（糖尿病、静脉、压力相关等）、感染状况（感染 - 清洁）、渗出物类型（浆液性、纤维蛋白性、出血性、脓性）或伤口状况（焦痂、坏死、肉芽形成、上皮形成等）进行分类 [1]。在这些变量中，时间仍然是伤口结果最关键的决定因素。因此，在临床实践中，伤口通常根据其愈合轨迹分为急性或慢性 [2]。急性伤口包括创伤性、手术性或烧伤相关损伤（热、化学或电），通常经历预期的愈合阶段。严重烧伤代表一个全球健康挑战，其特征是复杂的病理生理过程，包括炎症延长、感染风险高以及潜在的瘢痕增生 [3]。有效的烧伤管理需要一种理想的敷料，它能保持湿润环境，管理渗出物，提供病原屏障，并理想地积极促进组织再生 [4]。当前的临床金标准，如磺胺嘧啶银乳膏和传统敷料，面临重大限制。虽然银是有效的抗菌剂，但它与上皮化延迟和成纤维细胞细胞毒性有关。同样，常见的天然聚合物如藻酸盐或壳聚糖，虽然具有生物相容性，但有时缺乏必要的生物粘附强度或加速深度烧伤愈合所需的具体信号调节。因此，迫切需要生物相容、无毒且生物活性的支架，能够主动调节伤口微环境。天然聚合物由于具有生物相容性，能被人体自然识别，是干细胞培养、组织工程和再生医学的首选。由这些聚合物生产的生物材料通过促进细胞粘附和受控药物释放，在组织再生中发挥关键作用，这得益于其多孔结构 [5]。除了纤维素、壳聚糖、胶原蛋白和藻酸盐等常用例子外，果聚糖是一种高分子量化合物，在该领域备受关注 [6]。果聚糖是一种可从微生物或植物来源获得的胞外多糖。它是由主要通过 β-(2→6) 糖苷键连接并带有 β-(2→1) 分支的 β-D-呋喃果糖基单元形成的果聚糖均聚物 [7]。广泛的微生物产生果聚糖，包括 *Aerobacter levanicum* [8]、*Bacillus licheniformis* [9]、*Bacillus polymyxa* [10]、*Bacillus subtilis* [11]、*Corynebacterium levaniformans* [12]、*Gluconacetobacter diazotrophicus* [13]、*Erwinia amylovora* [14]、*Pseudomonas syringae* 病原变种 [15]、*Pseudomonas aureofaciens*, *Pseudomonas* spp. [16]、*Streptococcus* spp. [12]、*Zymomonas mobilis* [17] 和 *Halomonas smyrnensis* [18]。植物来源的果聚糖通常表现出 2,000–33,000 Da 的平均分子量，而细菌果聚糖通常超过 500,000 Da 且通常具有分支 [19]。果聚糖在水和油中溶解性良好。它稳定且耐酸、碱和热。果聚糖具有成膜能力；它与盐和表面活性剂相容并表现出高持水性 [20]。除了强粘附力、成膜能力、粘度和稳定性外，果聚糖增强细胞增殖，并表现出益生元、抗刺激、抗氧化、抗癌和抗炎活性，使其对生物医学应用极具吸引力 [21]。通过同轴或单喷丝技术制备的电纺果聚糖基支架在组织工程中显示出潜力 [22]。在生物医学应用中，果聚糖与其他常用生物聚合物如藻酸盐、壳聚糖、明胶和胶原蛋白相比显示出一些优势。例如，在一项医学应用中，磷酸化果聚糖和壳聚糖被层层组装在玻片上形成薄膜；与类似制备的壳聚糖 - 藻酸盐膜相比，壳聚糖 - 果聚糖膜由于优异的粘附力支持了明显更高的细胞密度 [23]。在另一项研究中，将果聚糖与壳聚糖和聚环氧乙烷（PEO）混合产生的膜，其稳定性、柔韧性和透明度可以通过调整组分比例来增强；果聚糖通过促进细胞粘附和增殖改善了生物相容性 [24]。组织工程的最新进展显著改善了烧伤和伤口护理，在过去十年中使生存率提高到约 97%。传统上，创伤性伤口、溃疡、糖尿病病变和深部手术伤口通过移植和切除进行管理。尽管存在供区并发症和疼痛，自体移植仍然是标准，因为其感染和排斥风险较低。自 20 世纪 80 年代以来使用的培养的表皮自体移植对烧伤伤口尤为重要，尽管局限性包括愈合时间延长 [25]。异种移植和商业产品如 Alloderm?和 GraftJacket?提供了具有成本效益的替代方案。许多敷料掺入银成分以减少细菌污染 [26]，但银会延迟上皮化并产生细胞毒性，特别是对成纤维细胞和角质形成细胞 [27]。因此，植物来源的抗菌剂和天然聚合物正作为更安全的替代方案被研究 [28]。本研究假设来自 *Halomonas elongata* 的果聚糖基凝胶将通过增强组织再生和减少炎症反应来促进烧伤伤口愈合。因此，使用嗜盐细菌 *Halomonas elongata* 153B 产生的生物聚合物开发了果聚糖基凝胶结构，并通过体内实验评估了其烧伤伤口愈合功效。本研究由四个工作包组成：最初，生产果聚糖并以不同比例（5%、10%、15%、20%）与聚合物组分混合以配制凝胶，然后通过 FTIR 和流变学分析进行表征。通过人成纤维细胞细胞毒性测试确认了凝胶的生物相容性。随后，将凝胶应用于 140 只实验动物的烧伤伤口模型，并通过宏观、组织病理学、基因表达分析（IL-6, TNF-α）评估其生物活性。

章节片段材料黄原胶（CAS 号：11138-66-2）、聚乙烯醇（PVA）（CAS 号：341584）和卡波姆（CAS 号：9003-01-4）聚合物，马松三色染色试剂盒和 Verhoeff 弹性染色试剂盒均购自 Sigma-Aldrich Trading Company, Ltd。微生物果聚糖的生产果聚糖（L）在受控条件下由嗜盐分离株 *Halomonas elongata* 153B 微生物生产并纯化，方法如 Erdal-Alt?nta? 等人 [29] 所述。嗜盐果聚糖基凝胶配方的制备为了制备嗜盐果聚糖基凝胶，采用机械均质化方法嗜盐果聚糖基凝胶的制备和表征在制备嗜盐果聚糖基凝胶时，黄原胶（1% w/v）、聚乙烯醇（0.5% w/v）和卡波姆（0.5% w/v）的量保持不变，并通过机械搅拌器将除果聚糖以外的聚合物溶解在蒸馏水中制备基础凝胶。通过向基础凝胶中添加不同量的果聚糖聚合物获得嗜盐果聚糖基凝胶配方（L5, L10, L15 和 L20）。含和不含不同浓度果聚糖的凝胶的红外光谱

讨论本研究侧重于果聚糖基凝胶的表征及其体内性能的评估。果聚糖由 *Halomonas elongata* 153 R 生产，并制备了含有不同浓度果聚糖（5%、10%、15%、20%）并结合 PVA（0.5%）、黄原胶（1%）和卡波姆（0.5%）的凝胶配方。成功生产了四种不同的凝胶配方，并通过 FTIR、流变学分析和 SEM 进行了表征。在人评估了细胞毒性

结论在本项目研究中，开发了基于 HeL（*Halomonas* 果聚糖）的生物活性凝胶用于治疗烧伤伤口，并在体内烧伤模型中评估了获得的生物活性凝胶的组织再生活性。确定获得的生物材料被整合到基于 HeL 的凝胶的多孔结构中，而没有破坏 HeL 聚合物的结构。鉴于本研究，果聚糖凝胶可用于组织工程应用，特别是烧伤。

伦理批准埃斯基谢希尔奥斯曼加齐大学伦理委员会在非干预性临床研究范围内批准了本研究（决定日期 2023/03/07，编号 171/933）。

资助这项工作由埃斯基谢希尔奥斯曼加齐大学科学研究项目协调单位在资助编号#FCD-2023-2725 下支持。

CRediT 作者贡献声明A?：概念化、调查、监督、资金、写作 - 审阅与编辑；OEA：调查、方法、数据管理、写作 - 原稿；BNY：调查、方法、数据管理、写作 - 原稿；KCC：方法、写作 - 审阅与编辑；MD：正式分析、写作 - 审阅与编辑；OEI：方法、数据管理、写作 - 审阅与编辑；B?B：概念化、调查、方法、写作 - 审阅与编辑；BY：概念化。

利益冲突声明作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文报告的工作。

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Ahmet ?ABUK|?zlem ERDAL ALTINTA?|Belma NURAL YAMAN|K?smet ??V? ?ET?N|Murat DEM?RB?LEK|Oya ERALP ?NAN|Bülent ?a?lar B?LG?N|Boran YAL?IN|Dilan BARUT YAVA?|Elif BAYB?Rü|P?nar AYTAR ?EL?KEski?ehir Osmangazi University, Faculty of Science, Department of Biology, Eski?ehir, Türkiye