直接RNA测序揭示疟原虫基因表达的新见解

《TRENDS IN Parasitology》：New insights on Plasmodium gene expression from direct RNA sequencing

　　

牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology，ONT）直接RNA测序能够在无需cDNA转换的情况下对天然RNA分子进行测序。该长读长方法捕获跨越整个基因的全长读段，通过实现对非翻译区（untranslated region，UTR）、异构体和选择性剪接的分析，彻底改变了疟原虫（Plasmodium）基因表达的研究。此外，ONT为非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）、RNA修饰和多聚腺苷酸化尾动态提供了独特见解，这些正在拓展研究人员对疟原虫转录后调控的理解，包括配子体（gametocyte）和子孢子（sporozoite）中翻译抑制以外的过程。在此，研究人员讨论了直接RNA测序在疟原虫研究中的过去和未来应用，并强调了其优势、局限性和未来前景。

论文解读：ONT直接RNA测序在疟原虫基因表达研究中的应用与前景

疟原虫（Plasmodium）是导致人类疟疾的单细胞真核病原体，每年在全球造成约2.5亿临床病例，构成重大公共卫生负担。其生命周期极为复杂，涵盖人体和蚊体内的发育、胞内与胞外形式、无性与有性生殖以及静止和高运动性阶段。为完成这一复杂生命周期，疟原虫依赖不到6000个蛋白编码基因的精确时序表达。与锥虫等其他原生动物不同，疟原虫核基因以类似大多数真核生物的方式转录：由RNA聚合酶II以单顺反子形式转录，具有5′端帽子和3′端多聚腺苷酸化[poly(A)]尾，约55%的恶性疟原虫（P. falciparum）注释基因含有内含子。转录组技术的不断革新——从微阵列到RNA测序（RNA-seq），再到单细胞RNA测序（scRNA-seq）——已揭示疟原虫基因表达的严格调控，但短读长技术在基因密集的疟原虫基因组中难以准确解析转录本全长结构、非翻译区（UTR）边界及异构体信息。此外，cDNA依赖性测序方法在逆转录和PCR扩增过程中可能引入模板转换、自身引物等人工产物，导致反义RNA的假阳性鉴定。因此，需采用能够直接对天然RNA分子测序的新技术来克服上述局限。

针对这些问题，研究人员综述了ONT直接RNA测序在疟原虫基因表达研究中的过去与未来应用，重点阐述了该技术在转录本结构表征、非编码RNA分析、RNA修饰检测和多聚腺苷酸化尾动态研究方面的优势，同时指出了其通量较低、起始RNA需求量大等局限性。该综述发表于《TRENDS in Parasitology》，为疟原虫转录组学研究提供了系统性技术参考。

在技术方法方面，研究人员采用ONT直接RNA测序技术：首先将oligo-dT接头连接至RNA分子的poly(A)尾，并合成单链cDNA以稳定RNA并去除二级结构（该cDNA不参与测序）；随后将接头连接马达蛋白，引导RNA分子通过纳米孔，通过检测离子电流变化进行碱基识别。该技术无需逆转录和PCR扩增，可产生跨越完整mRNA的长读段。样本来源涵盖约氏疟原虫（P. yoelii）17XNL株以及P. falciparum无性血液期和成熟配子体等不同发育阶段。

**ONT直接RNA测序能够实现全长转录本、异构体和选择性剪接的鉴定**。Lindner等人对P. yoelii 17XNL株mRNA进行ONT直接RNA测序，结合Illumina短读段严谨定义了外显子、内含子和UTR，并鉴定了无性和有性血液阶段表达的选择性异构体。Lee等人对P. falciparum无性血液阶段的分析发现广泛的内含子保留现象，表明每个基因可表达多种异构体。ONT读段还鉴定到跨越多个连续基因的转录本，可能代表罕见异构体或多顺反子转录本，这一现象在隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）中亦有报道，可能代表一种真实的基因表达调控机制。值得注意的是，ONT读段从mRNA的3′端起始，5′端约13个核苷酸被系统性遗漏，且P. falciparum极高的AT含量（约80%）可能导致接头在基因内腺苷酸延伸处的错误连接，从而产生具有错误3′端的短转录本。

**超越mRNA**。ONT直接RNA测序还可用于表征核糖体RNA（rRNA）、转移RNA（tRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）。研究人员近期利用该技术检测成熟配子体中rRNA的降解，结合读段长度分析揭示了难以通过短读长RNA-seq检测的阶段特异性降解谱。在lncRNA研究方面，由于P. falciparum基因组基因密集，仅依赖短读段数据难以区分相邻或重叠的mRNA与lncRNA边界；ONT直接RNA测序直接对RNA分子测序，绕过了逆转录和PCR扩增的缺陷，实现了lncRNA的可靠鉴定。Lee等人利用该技术手工注释了无性期寄生虫的lncRNA，研究人员进一步扩展了该工作，生成了无性和有性发育期间表达的lncRNA目录，确定了其阶段特异性表达，并探究了lncRNA与其邻近蛋白编码基因表达的相关性。

**ONT直接RNA测序为碱基修饰和Poly(A)尾动态提供独特见解**。由于直接对天然RNA分子测序，离子电流信号的变化可指示RNA核苷酸上的化学修饰。一项近期研究利用ONT直接RNA测序鉴定了P. falciparum全转录组中的N⁶-甲基腺苷（m⁶A），发现m⁶A富集于多聚腺苷酸化位点附近，对控制转录终止具有重要作用。该研究同时强调，当前用于从ONT测序数据中鉴定RNA修饰的计算模型大多在模式生物上训练，缺乏验证并存在过度预测问题，需借助独立方法进行正交验证。此外，ONT直接RNA测序理论上可测定每条mRNA分子的poly(A)尾长度，为理解mRNA稳定性和转录后调控提供关键信息，但同聚物区域的精确判定仍面临技术挑战。

在讨论部分，研究人员指出ONT直接RNA测序作为长读长技术，为疟原虫基因表达研究开辟了新途径。其能够提供转录本结构信息，改善基因及其UTR的注释，并分析异构体表达——这对于理解疟原虫基因表达调控尤为重要，因为“一个基因—一个转录本”的传统教条正受到生命周期中阶段特异性异构体表达和选择性UTR使用的越来越多证据的挑战。该技术独特的直接RNA测序能力还实现了对非编码RNA、poly(A)尾长度和RNA修饰的可靠表征，这些都可能通过调节mRNA稳定性或翻译效率在转录后调控中发挥关键作用。研究结论表明，ONT直接RNA测序为研究疟原虫基因调控的复杂过程提供了额外工具，有助于确定转录和转录后机制调控基因表达的相对重要性及相互作用。回答这些基本问题不仅有助于更全面地理解疟疾寄生虫如何在其发育过程中协调约5000个基因的表达，还将指示哪些生物学过程和分子通路可能成为良好的治疗靶点，以破坏这些功能并改善疟疾的控制与消除。