在骨肉瘤中，STK25的转录后沉默通过METTL3–YAP–GPX4轴调控机制促进细胞对铁死亡（ferroptosis）的逃避

《Cancer Letters》：Epitranscriptomic silencing of STK25 promotes ferroptosis evasion via the METTL3–YAP–GPX4 axis in osteosarcoma

　　

摘要

骨肉瘤（OS）是一种侵袭性骨恶性肿瘤，其在复发和转移性疾病中的预后较差。尽管铁死亡（ferroptosis）被认为是一种有前景的治疗策略，但在骨肉瘤中的调控机制仍不完全清楚。在这里，我们发现STK25是调节铁死亡易感性和肿瘤生长的关键因子。通过对亲本细胞系和多药耐药骨肉瘤细胞系的转录组分析，发现耐药细胞系中STK25的表达水平较低。在一项回顾性组织微阵列研究中，低水平的STK25表达与新辅助化疗后的低肿瘤坏死率及较短的生存期相关。从机制上讲，METTL3的过表达以m⁶A位点依赖的方式降低了STK25的活性并加速了STK25 mRNA的降解。STK25的缺失伴随着Hippo通路活性的降低、YAP在细胞核内的定位增加以及GPX4表达的增加，而STK25的恢复则增加了LATS1和YAP的磷酸化，减少了GPX4的表达，并使骨肉瘤细胞对铁死亡更加敏感。GPX4的重新表达部分恢复了由STK25过表达引起的细胞活力和氧化应激表型，这支持GPX4作为功能性下游效应物的作用。在异种移植模型中，STK25的过表达显著抑制了肿瘤生长并增强了铁死亡相关的变化。这些发现支持了一个METTL3–STK25–YAP–GPX4调控模型，该模型将表观遗传调控与骨肉瘤的铁死亡易感性联系起来，需要进一步的临床前和临床验证。

引言

骨肉瘤（OS）是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤[1]，其特征是生长迅速且具有较高的肺转移倾向[2]。尽管采用了包括新辅助化疗和手术切除在内的强化治疗方案，但患者的生存率在过去几十年中趋于平稳。较差的病理学反应、复发和转移进展仍是主要的临床挑战，但治疗失败的具体生物学机制具有异质性[2]。因此，阐明这些可攻击性的脆弱性背后的机制对于开发新的治疗策略以改善骨肉瘤患者的生存至关重要。

丝氨酸/苏氨酸激酶25（STK25）属于MST家族激酶，调节包括Hippo信号通路、高尔基体动态和细胞凋亡在内的关键细胞过程[3]。新兴证据表明，STK25在癌症中发挥着依赖特定环境的角色。它已被证实通过激活上皮-间充质转化（EMT）程序促进乳腺癌的转移[4]，但似乎通过与高尔基体磷酸蛋白3（GOLPH3）的相互作用和调节糖酵解来抑制结直肠癌的发生[5]。此外，STK25的沉默可以改变肝细胞癌的恶性表型，包括减少增殖和侵袭性以及增加凋亡[6]。然而，其在骨肉瘤中的具体功能仍不明确，需要进一步研究。

铁死亡是一种依赖于铁的受调控的细胞死亡形式，由致命的脂质过氧化驱动，是一种有前景的策略，可用于消除逃避传统凋亡的治疗方法[7]、[8]、[9]、[11]。铁死亡防御的核心是谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），这是一种硒蛋白，通过减少细胞毒性脂质过氧化物起主要调节作用。有趣的是，Hippo-YAP信号通路作为GPX4表达的关键上游调节器，将致癌信号与铁死亡抗性联系起来[12]、[13]。虽然已知YAP的激活会转录上调GPX4从而抑制铁死亡，但STK25-YAP-GPX4轴内的功能相互作用及其对骨肉瘤铁死亡易感性的影响的具体机制仍需进一步阐明。

RNA甲基化是一种重要的表观遗传调控机制，通过多种途径对肿瘤发病机制产生重要影响[14]、[15]。在已知的150多种RNA修饰方式中，N6-甲基腺苷（m6A）是最常见的mRNA标记物，其动态变化由甲基转移酶复合体（“写入者”）和去甲基化酶（“擦除者”）共同调控[14]、[16]、[17]。核心的“写入者”复合体包括甲基转移酶类似物3（METTL3）、METTL14和Wilms’肿瘤1相关蛋白（WTAP），它们催化m6A的添加；而AlkB同源物5（ALKBH5）和脂肪质量肥胖相关蛋白（FTO）则作为“擦除者”去除这些标记[18]、[19]。重要的是，METTL3作为主要催化亚基，在人类癌症中经常过度表达，并通过调节mRNA的稳定性和翻译效率促进肿瘤发生。在骨肉瘤中，升高的METTL3介导的m6A甲基化与侵袭性进展和转移相关；然而，这些表型的关键m6A修饰靶标尚未完全确定[20]。我们假设METTL3介导的m6A修饰通过选择性地沉默肿瘤抑制基因（如STK25）来促进骨肉瘤的进展。

在这里，我们发现了一个新的METTL3–STK25–YAP–GPX4信号轴，该轴对骨肉瘤的铁死亡易感性和进展具有关键调控作用。我们证明METTL3介导的STK25转录本的m6A甲基化降低了其在骨肉瘤细胞中的表达。STK25的缺失促进了YAP的过度激活，上调了GPX4的表达，从而增强了铁死亡抗性。相反，STK25的恢复激活了Hippo信号通路，抑制了YAP的活性，降低了GPX4的表达，并使细胞对铁死亡更加敏感。通过全面的体外和体内分析，我们证明STK25的重新激活通过克服铁死亡抗性，显著抑制了骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和肿瘤生长。总体而言，我们的发现将METTL3–STK25–YAP–GPX4轴确定为骨肉瘤逃避铁死亡的关键调节因子，并强调了其在改善患者预后方面的治疗潜力。

章节摘录

细胞培养

人类骨肉瘤细胞系143B（RRID: CVCL_2270）、HOS（RRID: CVCL_0312）和U2OS（RRID: CVCL_0042）来自中国上海的国家认证细胞库；人类多药耐药（MDR）细胞系143B-R、HOS-R和U2OS-R由上海 General Hospital的Zhengdong Cai博士提供[21]。MDR细胞系的分离和表征方法如前所述[21]。在实验前，我们在我们的实验室重新验证了这些细胞的耐药表型。

STK25下调与骨肉瘤的较差病理学反应和不良预后相关

为了识别MDR骨肉瘤模型中的候选调控因子，我们对亲本细胞系（U2OS、HOS和143B）及其耐药衍生物（U2OS-R、HOS-R和143B-R）进行了RNA-seq分析。差异表达分析发现了783个差异表达基因（DEGs），其中408个基因下调，375个基因上调（图1A）。在这些DEGs中，STK25在耐药细胞系中的下调最为显著（倍数变化 [log₂FC] = -3.24，p = 0.010）（图1B）。我们确认了这一结果。

讨论

在这项研究中，我们发现STK25是骨肉瘤中的一个关键肿瘤抑制剂，它通过调节铁死亡来限制肿瘤进展。机制上，METTL3介导的m⁶A甲基化促进了STK25转录本的降解，从而削弱了Hippo信号通路。这导致YAP磷酸化减少，使其更容易进入细胞核并增强其转录活性，最终导致GPX4的表达上调。这一级联反应使...

结论

总体而言，我们的发现定义了一个致癌信号轴METTL3–STK25–YAP–GPX4，该轴通过将m⁶A依赖的表观遗传沉默与铁死亡逃避联系起来，促进骨肉瘤的进展。机制上，METTL3介导的过度甲基化抑制了STK25的表达，导致Hippo信号通路受损，YAP磷酸化降低，随后YAP在细胞核内的积累增加。这使得YAP依赖的GPX4表达上调，最终抑制了...

CRediT作者贡献声明

Zhusheng Zhang：撰写原文草稿、可视化处理、验证、软件应用、方法学设计、数据分析、数据整理。Fangqiong Hu：撰写原文草稿、验证、数据分析。Junxiang Wen：撰写与编辑、数据分析。Yucheng Fu：撰写与编辑、数据分析。Qi Liu：撰写原文草稿、数据整理。Tao Liang：撰写原文草稿、数据整理。Jun Wang：撰写原文草稿、数据整理。Yuhui Shen：撰写...

伦理声明

所有参与者或其法定代表均已口头同意参与本研究并发表相关文章。由于本研究仅涉及去识别的临床数据，机构审查委员会免除了对知情同意的要求。参与者的隐私权得到了尊重。

本研究遵循相关法律法规、监管框架和指南进行。本研究已获得...

利益冲突声明

所有作者声明没有潜在的利益冲突。

数据声明

由于隐私保护要求，本研究生成的测序数据不对外公开，但可以根据相应作者的合理请求提供。

资金来源

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82203084和82473015）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢所有作者在统计分析、数据处理、手稿准备和修订方面的宝贵贡献。

Zhuochao Liu|Zhusheng Zhang|Fangqiong Hu|Junxiang Wen|Yucheng Fu|Qi Liu|Tao Liang|Jun Wang|Yuhui Shen|Qiyuan Bao|Weibin Zhang上海交通大学医学院瑞金医院创伤与骨科研究所上海骨关节疾病预防与治疗重点实验室，上海，中国