《Carbohydrate Polymers》：A
N-acetylglucosamine containing exopolysaccharide from a specific gene cluster in
Bacillus thuringiensis: Structural characterization and its role in UV-proof biofilm
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摘要广泛使用的生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌（Bt）的田间效力受到紫外线（UV）辐射的严重影响。主要由胞外多糖（EPS）构成的生物膜基质可以增强Bt LA32的耐紫外线能力。然而，EPS合成的遗传决定因素、EPS对生物膜介导紫外线防护的贡献及其主要结构特征尚不清楚。本研究鉴定了Bt
摘要 广泛使用的生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌 （Bt）的田间效力受到紫外线（UV）辐射的严重影响。主要由胞外多糖（EPS）构成的生物膜基质可以增强Bt LA32的耐紫外线能力。然而，EPS合成的遗传决定因素、EPS对生物膜介导紫外线防护的贡献及其主要结构特征尚不清楚。本研究鉴定了Bt LA32中与EPS合成相关的一个完整的染色体基因簇。通过CRISPR-Cas9敲除该基因簇，显著降低了0.2 M NaCl洗脱EPS组分（命名为Bt-EPS-2）的产生，并削弱了生物膜形成能力和耐紫外线能力。结构表征表明，Bt-EPS-2主要由分支氨基多糖组成。主链可能由连续的β-D-1,3-Glcp NAc残基与β-D-1,4-Glcp NAc间隔排列构成，并在β-D-1,3-Glcp NAc残基的O-4位通过β-D-t-Glcp NAc进行分支。外源补充Bt-EPS-2部分恢复了Bt LA32的耐紫外线能力，这与紫外线衰减和减轻紫外线诱导的活性氧有关。这些发现为eps BGC、Bt-EPS-2产生、生物膜结构和耐紫外线表型之间的关联提供了证据，为未来菌株工程或基于EPS的制剂策略以提高Bt田间持久性奠定了基础。
引言 Bt是一种产孢的革兰氏阳性细菌，因其能产生特异性破坏鳞翅目和鞘翅目害虫中肠组织的杀虫蛋白而广泛用于害虫防治（Caccia等，2016；Singh, Samiksha等，2021）。然而，Bt制剂的田间效力受到紫外线辐射的严重影响。紫外线照射会诱导大量活性氧（ROS）产生，严重损害细菌活力，降低杀虫持久性和效力（Idris, Fan等，2024；Idris, Li等，2024；Rao等，2022）。因此，提高耐紫外线能力和减轻紫外线诱导的损伤是延长Bt制剂田间性能的关键。
目前包括微胶囊化、开发耐紫外线转基因菌株以及添加放射保护化合物（如黑色素或L-酪氨酸）等策略已被用于提高Bt的耐紫外线能力（Idris, Fan等，2024；Idris, Li等，2024；Wu等，2025）。然而，由于生产过程复杂、成本高以及基因改造微生物农药的监管障碍，这些方法在Bt生物农药产业中的实际应用仍然面临挑战。另一种途径是利用细菌形成生物膜的本征能力。生物膜是在不利环境条件下形成的具有空间结构、被基质包裹的细菌群落。它们能够保护细菌免受温度波动、pH变化、紫外线辐射、渗透压胁迫、营养匮乏和外部机械力的影响。我们此前的研究证明，形成生物膜的Bt LA32菌株表现出显著增强的耐紫外线能力和杀虫活性（Li等，2021；Zhao等，2025）。这种协同增效突显了生物膜形成在提高Bt持久性方面的重要性。
生物膜主要由胞外多糖（EPS）、蛋白质和胞外DNA（eDNA）组成（Singh, Datta等，2021）。在生物膜形成过程中，主要由EPS构成的细胞外基质起着关键作用。最初，细菌产生胞外多糖并将其转运至细胞外环境。EPS的黏附特性使其能够结合微生物细胞并促进其附着于固体表面，从而促进初始细菌定殖（Tian等，2014）。此外，复杂的EPS网络提供了结构支架，作为抵御恶劣环境条件的屏障，同时保持水分和营养物质以支持细菌群落的存活（Ma等，2022）。此外，目前对模式生物膜形成菌株（如枯草芽孢杆菌 和铜绿假单胞菌 ）的遗传研究表明，生物膜相关EPS的生物合成主要由染色体EPS合成交互基因簇（BGCs）调控（Dogsa等，2024；Gheorghita等，2023）。这使得EPS成为操纵生物膜形成和性质的主要靶标。然而，Bt LA32基因组中是否存在功能性eps BGC尚未确认，其与生物膜形成和耐紫外线能力的关系在很大程度上仍未被探索。
我们假设染色体编码的eps BGC可能有助于Bt LA32通过生物膜介导的紫外线胁迫防护。为验证这一假设，本研究采用全基因组测序结合生物信息学分析来鉴定Bt LA32中的潜在eps BGC。随后构建CRISPR-Cas9介导的BGC敲除突变体（Δeps A-P），以评估该基因簇对EPS产生、生物膜形成和内在耐紫外线能力的贡献。接着，利用核磁共振波谱、甲基化分析和基于质谱的低聚糖分析相结合的方法研究纯化EPS的主要结构特征，从而为其耐紫外线表型的解释提供结构背景。最后，通过在体外以特定浓度补充EPS来评估EPS的紫外线保护活性及其可能的贡献因素。通过整合遗传学、生物化学、结构学和功能性证据，本研究为eps BGC、Bt-EPS-2产生和生物膜相关耐紫外线能力之间的关联提供了证据，为未来的工程改造或制剂策略奠定了基础。
各章节摘要 微生物和试剂 Bt LA32菌株从可湿性粉剂制剂中分离获得（32,000 IU/mg，福建绿壳生物农药有限公司）。大肠杆菌 TOP10和JM110感受态细胞由天根生物技术有限公司（北京，中国）提供。用于CRISPR-Cas9介导基因敲除的质粒pJOE8999由华中农业大学彭东海教授慷慨赠送。用于基因编辑的酶包括T4 DNA连接酶、Bsa I和Sfi I限制性内切酶，
一个内嵌于染色体中的高度保守的16基因eps BGC赋予Bt LA32杂多糖合成和耐紫外线能力 Bt LA32的染色体长度为5,705,733 bp，G+C含量为35.29%（图S3a）。Bt LA32的完整基因组序列已提交至NCBI（GenBank:
CP169882 ）。在Bt LA32中鉴定了六类主要的碳水化合物活性酶，共包含146个碳水化合物代谢相关基因（图S3b）。基于全基因组序列的系统发育分析表明，Bt LA32与Bt GC-91聚在同一进化枝中，具有较高的置信度值
讨论 提高Bt的耐紫外线能力是延长基于Bt的生物农药田间持久性的关键瓶颈。生物膜增强细菌环境胁迫耐受性的能力使其成为提高Bt菌株耐紫外线能力的有前景的策略。然而，生物膜组成的复杂性和生物膜形成涉及的多种信号通路为利用生物膜进行紫外线防护带来了显著挑战（Vani等，2023）。作为主要
结论 本研究鉴定了与Bt LA32产生的富含氨基糖的EPS生物合成相关的一个特定16基因簇。遗传学破坏该基因簇显著降低了Bt-EPS-2组分的产生并削弱了生物膜形成，支持了eps BGC、Bt-EPS-2产生和EPS依赖性生物膜发育之间的关联。结构分析表明，Bt-EPS-2主要含有分支氨基多糖。氨基多糖的主链可能由
作者贡献声明 杨小龙： 论文撰写—审阅与编辑、论文撰写—初稿、形式化分析、数据整理、概念化。陈岚： 数据整理。苏仲增： 数据整理。杨佳洪： 数据整理。陈杰： 数据整理。王子轩： 调查。黄天培： 指导、项目管理、方法学、调查。
未引用参考文献 Vijayakrishnan等，2011
致谢 本项目由福建省科技计划项目 （编号：2025N5201）、南平资源产业化化工项目 （编号：N2023Z007）、国家自然科学基金委员会 （编号：31672084）以及福建省农业种质资源保护与利用项目 资助。
杨小龙|陈岚|苏仲增|杨佳洪|陈杰|王子轩|黄天培
国家农业林业生物安全重点实验室 & 生物农药与化学生物学教育部重点实验室 & 生物农药研究中心，福建农林大学生命科学学院，中国福州
