《Carbohydrate Polymers》：Glyoxyl-agarose immobilized
Bacillus subtilis chitosanase as a reusable biocatalyst for modulated production of chitooligosaccharides
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摘要由于壳聚糖酶在酸性、高温条件下不稳定，难以生产性质一致的超低分子量壳聚糖和壳低聚糖（COS）。为此，将一种重组壳聚糖酶通过多点共价结合固定化于乙二醛活化的琼脂糖上，以提高其稳定性并影响其水解模式。固定化酶在pH 4.5和55 °C条件下表现出更高的活性和稳定性，而游离酶在
摘要
由于壳聚糖酶在酸性、高温条件下不稳定，难以生产性质一致的超低分子量壳聚糖和壳低聚糖（COS）。为此，将一种重组壳聚糖酶通过多点共价结合固定化于乙二醛活化的琼脂糖上，以提高其稳定性并影响其水解模式。固定化酶在pH 4.5和55 °C条件下表现出更高的活性和稳定性，而游离酶在此条件下活性迅速丧失。固定化还降低了温度敏感性，并可在10次重复使用循环中保持持续催化能力。尺寸排阻高效液相色谱（HPLC）显示游离酶和固定化酶的平均分子量降低幅度相似，而动态光散射表明固定化加速了更窄、更稳定粒径的发展。MALDI-TOF光谱显示两者存在定性差异，固定化酶表现出更持久且受限的低聚合度（DP）信号模式，主要与DP2–DP4寡聚物相关。这些结果表明，多点共价固定化不仅能够稳定酶结构，还能影响壳聚糖解聚产物的时间演变。将酶固定化于乙二醛活化的琼脂糖上增强了其稳定性，并产生了更一致、更具特征性的水解产物分布，支持固定化作为一种增强生物催化性能并定制聚合物降解的策略，而无需改变酶的初级结构。
引言
壳聚糖水解产物和壳低聚糖（COS）是通过壳聚糖的部分解聚获得的，作为来自可再生和海洋生物质的增值功能性产品，引起了越来越多的关注（Li等，2024年）。其理化性质、溶解性和生物活性使COS在生物医学、农业、食品技术和功能材料领域具有吸引力。重要的是，这些性质强烈依赖于壳聚糖混合物的分子大小和分布，这使得定制化生产含COS的水解产物成为壳聚糖增值策略中的关键挑战（Gon?alves, Ferreira & Louren?o, 2021年）。
COS的调控生产仍然是壳聚糖生物加工中的主要挑战，因为COS的功能性能与其聚合度和分子量分布密切相关（Gui等，2025年）。利用壳聚糖酶进行酶水解被广泛认为是化学方法的可持续和选择性替代方案；然而，游离酶的实用使用往往受到酸性条件下稳定性不足、操作温度范围狭窄以及对产物分布控制有限等因素的限制（Cheng等，2022年；Nguyen等，2025年）。特别是，游离壳聚糖酶倾向于促进广泛的二次水解，导致异质性寡聚物混合物，阻碍了需要一致且明确定义的COS种群的应用（Gui等，2025年）。
为了缓解这些局限性，酶固定化作为增强催化剂稳定性、可重复使用性和操作稳健性的策略已被广泛探索（Cheng等，2022年；Kuroiwa等，2024年）。各种固定化平台已被证明能够提高几丁质酶和壳聚糖酶的热稳定性和pH稳定性，并延长其在间歇和连续操作下的催化寿命（Charoenpol等，2023年；Cheng等，2022年）。然而，在大多数情况下，固定化主要被设计为稳定酶并方便其回收，载体材料起到的作用相对被动。因此，虽然报道了操作稳定性的提高，但酶固有的水解行为以及由此产生的COS产物分布往往仅受到边际影响（Kuroiwa等，2024年）。
与此同时，早期努力集中在利用蛋白质工程控制COS分子量分布方面。最近的研究表明，定点诱变和酶进化可以影响底物结合模式、切割模式以及一次水解和二次水解事件之间的平衡，从而在一定程度上控制COS的分布（Gui等，2025年；Martínez等，2026年）。这些策略凸显了酶结构在决定产物选择性方面的重要性；然而，它们本质上具有酶特异性，且通常涉及相当大的实验复杂性。其他能够调节水解产物分布并提高操作稳定性的酶翻译后修饰方法仍然具有相当大的研究兴趣。
在此背景下，基于多糖的固定化载体提供了一个有前景但尚未充分探索的机会，可以超越被动的酶稳定化策略。由于与壳聚糖的化学相似性及其高度水合的柔性聚合物网络，多糖基质有可能影响固定化酶周围的局部微环境（Yu等，2025年）。基于多点结合的共价固定化策略，例如采用乙二醛活化载体的策略，已被证实能够刚化酶结构并增强对热失活和化学失活的抵抗力（Guisán, 1988年；López-Gallego等，2013年）。然而，对于壳聚糖水解等多步反应，尚不清楚在多糖载体上的固定化能在多大程度上影响底物可及性、中间寡聚物的扩散以及最终决定COS分子量分布的二次水解事件的进程（Muller等，2022年）。因此，酶固定化，特别是在多糖基载体上的固定化，其超出提高酶稳定性之外的潜力尚未得到系统研究。具体来说，共价固定化是否能通过限制二次水解来调节水解产物和COS丰度的最终分子量分布仍是一个悬而未决的问题，尤其是在与目前主导该领域的蛋白质工程策略进行比较时（Gui等，2025年）。
本研究调查了重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在乙二醛活化琼脂糖上的共价固定化。该工作基于这样的假设：在多糖基质上的固定化不仅作为稳定化策略，还影响壳聚糖水解的进程和由此产生的产物的时间演变，可能通过改变底物可及性和产物扩散来实现。通过将酶学表征与对所得壳聚糖水解产物的互补分析相结合，我们旨在评估在多糖基载体上的固定化是否能不仅影响酸性及中高温条件下的酶稳定性，还能影响壳聚糖水解的分子特征和产物分布的时间演变。具体而言，本研究探讨了多点共价固定化是否能超越其传统的稳定作用，作为一种功能性策略来调节壳聚糖解聚的时间进程及其产生的水解产物分布。通过这种方法，我们将枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在乙二醛活化琼脂糖上的固定化评估为与蛋白质工程互补的策略，用于调节壳聚糖解聚并生成具有不同分子特征的水解产物。因此，本工作的新颖性在于探索固定化不仅作为提高酶稳定性和可重复使用性的手段，还作为在不改变酶初级结构的情况下调节聚合物水解进程及其产物分布的翻译后策略。
章节摘要
化学品
使用以下分析级试剂：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、磷酸氢二钾（K2HPO4）、硫酸卡那霉素、蛋白胨、酵母提取物、D-葡萄糖胺和环氧氯丙烷（C3H6O2）购自Merck（德国达姆施塔特）。6% BCL琼脂糖珠标准品购自Agarose Bead Technologies（ABT，西班牙马德里）。来自虾壳的壳聚糖，实用级（Sigma 41,796，脱乙酰度>75%，分子量190,000–375,000 Da）购自Sigma-Aldrich公司（Steinheim,
结果
异源生产获得了有活性的游离壳聚糖酶，该酶作为固定化和对比研究的参考生物催化剂。随后评估了共价固定化对酶性能的影响。
结论
在本工作中，将重组枯草芽孢杆菌壳聚糖酶从培养上清液直接通过多点共价结合固定化于乙二醛活化的琼脂糖上，获得了一种能够在酸性和中高温条件下运行的稳健生物催化剂。固定化过程简单高效，在结合过程中保留了酶活性，获得了活性损失极小的稳定固定化体系。此外，开发了一种固定化...
CRediT作者贡献声明
Karen Rodríguez-Nú?ez：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，数据整理，概念构思。Valeria Vásquez：撰写—审阅与编辑，数据整理。Claudia Vásquez：数据整理。Akira Onoda：撰写—审阅与编辑，调查研究。Ronny Martínez：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，资源获取，方法论，调查研究，经费获取，概念构思。Claudia Bernal：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，方法论，
写作过程中生成式人工智能和人工智能辅助技术的声明
在准备本工作期间，作者使用了OpenAI的ChatGPT来生成图形摘要。作者随后根据需要审阅和编辑了内容，并对发表的工作承担全部责任。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些关系可能会影响本文所报道的工作。
致谢
R. Martínez感谢ANID FONDECYT常规项目1230483的资助。本研究得到了由JST/JICA资助的SATREPS项目"智利可持续渔业高价值生物产品回收（ReBiS）"（项目编号JPMJSA2206）以及ANID FONDEQUIP EQ.M220018的支持。
Karen Rodríguez-Nú?ez|Valeria Vásquez|Claudia Vásquez|Akira Onoda|Ronny Martínez|Claudia Bernal
酶技术生物加工实验室，食品工程系，拉塞雷纳大学，Raúl Bitrán 1305号，1720010，智利拉塞雷纳
