《Microbiology Spectrum》：Cell recovery and DNA extraction methods skew relative abundance estimations of foodborne pathogens and spoilage organisms on stainless steel surfaces
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摘要：针对食品设施表面微生物群的扩增子测序研究常报道细菌和真菌的相对丰度。然而，不同细胞类型间的生理差异可能导致细胞回收率和DNA产量的可变性，从而扭曲相对丰度估算。本研究评估了：(i)海绵拭子表面采样后不同细菌和真菌物种间细胞回收率的差异，以及(ii)DNA
摘要：针对食品设施表面微生物群的扩增子测序研究常报道细菌和真菌的相对丰度。然而，不同细胞类型间的生理差异可能导致细胞回收率和DNA产量的可变性，从而扭曲相对丰度估算。本研究评估了：(i)海绵拭子表面采样后不同细菌和真菌物种间细胞回收率的差异，以及(ii)DNA提取方案对人工接种不锈钢表面相对丰度估算的影响。结果表明，大肠杆菌(Escherichia coli)(革兰氏阴性细胞)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(革兰氏阳性菌)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(细菌芽孢)、酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus suci)(细菌芽孢)、暗形态外瓶霉(Exophiala phaeomuriformis)(真菌细胞)和费氏曲霉(Aspergillus fischeri)(真菌孢子)在不锈钢表面的回收率存在显著差异(P < 0.05)。营养细胞(E. coli和L. monocytogenes)经表面拭子采样的平均回收率(2.9%–6.6%)低于孢子(35.2%–94.9%)。将DNA提取中的珠磨步骤延长10分钟通常可提高产量，但影响因微生物而异。例如，E. coli的DNA产量从70 ng/mL增至84 ng/mL，而L. monocytogenes仅从23.2 ng/mL增至29.2 ng/mL。细胞回收和DNA提取影响了扩增子测序的相对丰度估算。在起始相对丰度均为25%的条件下，L. monocytogenes在下游计算中被低估(9%–17%)，而B. cereus被高估(36%–44%)。这些结果强调了扩增子测序在表征食品设施表面微生物群方面的局限性，并凸显了改进当前拭子采样和DNA提取方法的必要性。
重要性：扩增子测序已被用于表征设施表面的微生物群落。然而，评估扩增子测序流程在定量这些微生物群落中腐败菌和病原菌准确性的研究较少。本研究评估了扩增子测序在评价食品加工环境中常见腐败菌和病原菌相对丰度的准确性。结果揭示了由于细胞回收和DNA提取方法的局限性导致的相对丰度偏差。这些发现揭示了食品设施表面微生物群表征中存在的潜在偏差，以及改进当前回收和提取方法以提高微生物群表征准确性的必要性。
论文解读：食品加工环境表面微生物组研究中的方法学偏差评估
一、研究背景与意义
食品加工环境中表面微生物群落的准确表征对于食品安全管理至关重要。扩增子测序技术已被广泛应用于食品设施表面微生物群落的组成分析，通过16S rRNA基因和ITS区域的序列变异来鉴定细菌和真菌的物种组成，并计算各分类单元的相对丰度。然而，该技术的工作流程包括表面拭子采样、DNA提取、目标区域PCR扩增和测序分析等多个环节，每个环节都可能引入系统性偏差。食品设施表面存在多样化的微生物群落，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌等，这些微生物在细胞大小、细胞壁厚度、表面疏水性等理化性质上存在显著差异，这些差异可能影响细胞在表面上的附着强度、拭子回收效率以及后续DNA提取中的裂解效率。
目前，关于海绵拭子对不同细胞形态微生物回收效率的比较研究主要集中于革兰氏阳性和阴性细菌，而对细菌芽孢、真菌菌丝和分生孢子等其他形态类型的回收差异报道有限。此外，常用的商业DNA提取试剂盒对芽孢形成菌的裂解效率不足，可能导致这类微生物的相对丰度较低估。针对这些问题，本研究系统评估了海绵拭子回收和改良DNA提取方法对六种具有不同形态特征的代表性食源性病原菌和腐败微生物相对丰度的影响，为改进食品加工环境表面微生物群落的表征方法提供了重要的实验依据。
二、主要技术方法
本研究构建了包含六种代表性微生物的人工模拟菌群(microbiota)，包括两种细菌芽孢菌(酸土脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus suci和蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus)、两种营养细胞型细菌(大肠杆菌Escherichia coli和单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes)以及两种真菌(暗形态外瓶霉Exophiala phaeomuriformis和费氏曲霉Aspergillus fischeri)。研究采用3M海绵拭子从不锈钢表面采集微生物，通过平板计数法计算各物种的回收率。在DNA提取优化实验中，研究人员比较了标准PowerSoil试剂盒方案与三种改良方案(延长珠磨时间10分钟、95°C热处理预处理、65°C热处理预处理和溶菌酶预处理)的提取效率，以DNA产量和qPCR循环阈值(Ct值)为评价指标。随后将优化后的提取方案应用于不同比例的人工菌群，通过16S rRNA V3-V4区域和ITS2区域的扩增子测序评估相对丰度的准确性。测序数据采用QIIME 2流程中的DADA2插件进行质控和去噪，基于SILVA 16S数据库进行物种注释，并利用q2-gcn-norm插件对16S rRNA拷贝数进行归一化处理。
三、研究结果
(一)海绵拭子回收率在微生物形态类型间的显著差异
通过在不锈钢表面进行接种和海绵拭子采样回收实验，研究人员发现六种微生物的回收率存在显著差异(P < 0.05)。营养细胞型细菌的回收率最低，其中E. coli的平均回收率仅为2.9% ± 3.0%，L. monocytogenes为6.6% ± 6.0%。相比之下，细菌芽孢和真菌繁殖体的回收率显著较高：B. cereus芽孢回收率达94.9% ± 5.0%，E. phaeomuriformis分生孢子回收率为80% ± 19%，而A. suci芽孢和A. fischeri子囊孢子的回收率分别为35.3% ± 11%和36% ± 12%。回收率的差异可能与不同微生物细胞大小、细胞壁结构及表面疏水性等理化性质相关，例如细胞尺寸超过表面粗糙度拓扑宽度时，流体剪切力对细胞去除的影响更为明显。
(二)延长珠磨时间对DNA提取效率的菌种依赖性影响
在优化DNA提取方法的实验中，研究人员以A. suci芽孢为模式菌株测试了四种改良方案。结果表明，延长珠磨时间10分钟(PS+10)能够使裂解液中的DNA浓度在所有三次重复试验中均有所增加(增幅为+0.6至+4.8 ng/mL)，差异具有统计学意义(P < 0.05)，而热处理和酶预处理方案的效果不具一致性。值得注意的是，qPCR检测显示PS+10方案并未持续降低Ct值，这提示延长珠磨时间所产生的机械剪切力可能导致DNA片段化，反而对后续PCR扩增效率产生不利影响。
(三)PS+10方案对不同微生物DNA提取的差异性改善
将PS+10方案应用于六种微生物的DNA提取后，研究发现其改善效果具有显著的物种依赖性。PS+10显著提高了E. coli(增加14.0至24.8 ng/mL)、A. suci(增加6.2至>8.4 ng/mL)、B. cereus(增加5.2至6.4 ng/mL)和E. phaeomuriformis(增加125至>557 ng/mL)的DNA产量。然而，该方案对L. monocytogenes和A. fischeri的提取效率未产生一致的改善效果，部分试验中甚至出现DNA产量下降。这种差异可能与细胞壁的刚性强度、细胞大小以及离心回收效率等因素有关。例如，L. monocytogenes体积较小(0.5 × 2 μm)，在离心过程中可能较难有效沉淀，导致DNA得率偏低。
(四)DNA提取效率差异导致相对丰度的系统性偏差
当使用PS+10方案对不同比例的人工菌群进行DNA提取和扩增子测序后，研究人员观察到测序所得相对丰度与理论值之间存在显著偏差(P < 0.05)。E. coli的相对丰度在所有菌群配比下均被显著高估，在等比例菌群中实测值达70.6%，而理论值仅为25.0%。E. phaeomuriformis的相对丰度同样被系统性高估。相反，B. cereus和L. monocytogenes在多数条件下被低估。qPCR扩增效率检测排除了PCR扩增差异作为主要偏差来源的可能性，表明DNA提取环节的差异是造成相对丰度偏差的主要原因。
(五)拭子回收与DNA提取的联合影响
在模拟真实采样流程的实验中，研究人员将等比例配比的六种微生物接种于不锈钢表面，经过拭子回收、PS+10法DNA提取和扩增子测序后，L. monocytogenes的相对丰度在三次重复试验中均显著低于理论值(P < 0.05)，实测范围为9%–17%，理论值为25%；而B. cereus的相对丰度则显著高于理论值，实测范围为36%–44%。通过选择性培养基对回收前后的活菌计数分析，研究人员确认拭子回收过程本身即会造成微生物群落组成的变化，例如回收率较低的E. coli和L. monocytogenes在回收后的菌群中所占比例下降，而回收率较高的B. cereus所占比例上升。此外，真菌群落的测序结果也偏离理论预期，E. phaeomuriformis的测序相对丰度(38%–40%)显著低于理论值(50%)，而A. fischeri则被高估；但在活菌计数中观察到与测序结果相反的趋势，提示真菌ITS区域的生物信息学分析流程可能导致分类聚类错误。
四、结论
本研究系统证明，扩增子测序工作流程中的细胞回收和DNA提取环节会显著扭曲食品加工环境表面微生物群落中腐败菌和病原菌的相对丰度估算。不同微生物在细胞形态、大小、细胞壁结构等生理特性上的差异是导致回收率和提取效率不均一的内在原因。研究指出，相对于细菌芽孢和真菌繁殖体，营养细胞型食源性病原菌如L. monocytogenes在拭子回收和DNA提取环节均面临效率低下的问题，导致其在测序结果中被系统性低估。这项研究提示，利用扩增子测序评估食品设施表面微生物群落时需谨慎解读相对丰度数据，同时强调了优化采样和提取方法的重要性。未来研究应着重探索改善革兰氏阳性菌和真菌裂解效率的策略，以减少DNA剪切并提高回收率，从而提升微生物群表征的准确性，为食品安全风险评估提供更为可靠的方法学支撑。该论文发表于《Microbiology Spectrum》。
