编辑推荐：
乳头体（MB）是位于下丘脑后下部腹侧表面的皮层下结构，构成Papez回路和边缘系统的整合节点。通过密集的纤维联系，它在海马-穹隆-丘脑前核系统中整合信息，在空间导航、情景记忆和情绪调节中发挥核心作用。然而，受传统研究范式限制，早期对MB功能和机制的研究一直将其
乳头体（MB）是位于下丘脑后下部腹侧表面的皮层下结构，构成Papez回路和边缘系统的整合节点。通过密集的纤维联系，它在海马-穹隆-丘脑前核系统中整合信息，在空间导航、情景记忆和情绪调节中发挥核心作用。然而，受传统研究范式限制，早期对MB功能和机制的研究一直将其视为单一功能单元。近年来，单核RNA测序（snRNA-seq）技术为解析脑区细胞组成提供了新视角。尽管已有关于MB的snRNA-seq研究报道，但不同物种间MB在单核水平的细胞组成异同尚未被系统分析。为填补这一空白，研究人员对小鼠、人类和家猪三种物种的MB进行了跨物种单核转录组分析。猪作为脑大小和神经解剖学特征与人类可比的大型哺乳动物代表被纳入研究。通过构建高分辨率单核图谱，研究人员系统表征了这些物种中MB的细胞组成、细胞间相互作用以及神经元亚群的关键功能基因特征。随后，通过用小鼠中鉴定的生物标志物对人和猪细胞亚群进行评分，并比较猪与人之间的异质性，研究人员发现了跨物种一致的转录特征，为MB的共享细胞特征提供了见解。
**论文解读：跨物种单核解析哺乳动物乳头体的细胞组成与功能特征**
**一、研究背景与科学问题**
乳头体（mammillary body, MB）作为Papez回路和边缘系统的关键皮层下结构，位于下丘脑后下部腹侧面，通过致密的神经纤维联系整合海马-穹隆-前丘脑系统的信息，在空间导航、情景记忆和情绪调节中发挥核心作用。解剖学上，MB可细分为外侧乳头体核（lateral mammillary nucleus, LM）和内侧乳头体核（medial mammillary nucleus, MM），后者进一步分为内侧部（MM-M）和外侧部（MM-L）。然而，受传统研究范式限制，早期研究常将MB视为单一功能单元。MB损伤可导致认知缺陷，其体积萎缩与阿尔茨海默病认知衰退、情绪障碍和精神分裂症显著相关。尽管近年来已有针对小鼠MB的单核RNA测序（snRNA-seq）研究报道，但不同物种间MB在单核分辨率水平上的细胞组成异同尚未被系统性阐明。该研究旨在构建小鼠、家猪和人类三种物种MB的跨物种单核转录组图谱，系统解析其细胞组成、空间分布及功能特征，揭示MB在进化过程中的保守性与物种特异性。该论文发表于《Cell Insight》。
**二、主要技术方法**
研究人员利用免疫荧光染色技术，使用小清蛋白（parvalbumin, PV）和钙结合蛋白D28k（calbindin-D28k, Calb1）标记，对小鼠、大鼠、猪、猴和人类MB的解剖分区进行比较分析。单核RNA测序数据方面，小鼠MB样本来源于35只小鼠的混合核（使用sCelluFlu-A平台，MGI DNBSEQ-T7测序），猪（n=2）和人类（n=3）MB样本使用MobiCube/MobiNova平台处理，基于Illumina NovaSeq6000平台测序。人脑组织来自华中科技大学解剖学系的3例男性死后脑组织样本（年龄分别为62、77和89岁）。此外还采用了荧光原位杂交（FISH）技术验证神经元亚型的空间分布，以及体外电生理记录评估MB神经元的固有兴奋性。生物信息学分析包括无监督聚类、差异基因表达分析、基因本体（Gene Ontology, GO）功能富集分析、SCENIC转录调控网络推断、CellChat细胞间通讯分析及ROGUE细胞纯度评估等方法。
**三、主要研究结果**
**1. 哺乳动物乳头体的单核图谱解析**
通过严格的质控，从小鼠、人类和猪MB中分别获得6,685、41,522和27,775个高质量单核转录组。基于已知和新鉴定的标记基因，细胞被分为七至九种主要细胞类型，涵盖胶质细胞群、神经元群、血管壁细胞群及少量免疫细胞，其中神经元占大多数。该数据集为哺乳动物MB的跨物种空间和转录组特征研究提供了宝贵资源。值得注意的是，免疫荧光染色揭示了跨物种MB结构的进化保守性与种间异质性——随着脑尺寸增大，MB的结构复杂性趋于增加。
**2. 小鼠MB神经元的转录组与空间特征**
基于reprimo（Rprm）和速激肽2（Tac2）的表达模式区分MM和LM神经元。与MB外部相邻神经元相比，MB内神经元表现出更高的兴奋性。通过FISH和空间定位分析，研究人员在小鼠MB中鉴定出五种神经元亚型：c1_Drd2（位于MM-M基底侧）、c2_Nos1（位于MM-L）、c3_Nts（对称分布于MM-M两侧）、c4_PV（分布于MM-M背侧和LM）以及c5_Tac2（分布于LM）。SCENIC分析揭示了各亚型特异的转录因子调控模块。对c2_Nos1（MM-L）簇的进一步亚聚类鉴定了四个亚簇，其中Tenm3?细胞定位于靠近MM-M区域，Tnc?细胞定位于靠近LM区域。
**3. 小鼠MB中配体-受体对揭示潜在的神经与旁分泌调控**
谷氨酸和GABA受体基因在MB各神经元亚型间表现出显著的转录异质性，其中LM与其他内侧区域差异最大。LM（c5_Tac2）神经元表现出较高的离子型谷氨酸受体和较低的代谢型谷氨酸受体基因特征评分。c2_Nos1和c4_PV神经元分别高表达GABAA和GABAB受体基因，而LM区域两类受体基因的表达均相对较低。LM神经元表达最高的谷氨酸产生相关基因信号，而c2_Nos1和c3_Nts神经元表现出较高的谷氨酸释放相关基因特征。细胞间通讯分析预测MM-L（c2_Nos1）神经元在MB中可能充当信号发送者，而LM（c5_Tac2）神经元主要作为信号接收者。Slit2-Robo1/2和Nrg1/2/3-Erbb4等配体-受体对在特定神经元亚型间的相互作用提示其在轴突导向、神经发育和突触可塑性中的潜在功能意义。
**4. 人MB神经元的转录异质性**
从3例人MB样本中提取兴奋性神经元，基于FOXB1、ONECUT2、MYO5B（MM标记）和UNC5D、TAC3、HTR2C（LM标记）等已知标记将神经元分为MM和LM两大类，MM进一步分为七个亚簇（MM0-MM6）。功能富集分析显示不同亚簇具有各异的功能特征：MM0富集轴突发生相关条目，MM1富集细胞呼吸和氧化磷酸化，MM3和MM4富集小GTPase介导的信号转导，MM2、MM5和MM6富集突触组织相关条目。以小鼠MM亚型标记基因对人工MM亚簇进行评分，未发现明确的——对应关系，提示尽管某些细胞类型标记在物种间保守，但同一细胞类型内的基因间关系在物种间不一定保守。
**5. 人MB中配体-受体对特征**
人MB中LM区域与小鼠一致，表现出较高的iGluR评分和较低的mGluR评分。LM高表达GRIA1、GRIA4、GRID1和GRID2；MM5特异高表达GRIN3A，与小鼠c1_Drd2亚型相似；MM2高表达GRIK2和GRM1，类似于小鼠MM-L（c2_Nos1）区域的特征。细胞间通讯分析显示LM参与的相互作用少于MM亚区，MM0、MM1和MM3主要作为信号源，MM4主要作为信号靶标。人和小鼠MB数据中共同鉴定到SLIT2-ROBO1/2和NRG1/2/3/4-ERBB4两个配体-受体对。
**6. 跨物种MB神经元的细胞异质性**
猪MB神经元分析流程与人类相似，MM分为七个亚簇。以小鼠MM亚型的同源标记基因对猪MM亚簇进行评分，发现猪亚簇3、6、2、4分别对应小鼠c1_Drd2、c2_Nos1、c3_Nts和c4_PV的较高评分，提示部分细胞亚群间存在共享特征基因。人和猪MB数据的整合分析显示，少突胶质细胞、小胶质细胞和神经元在物种间呈现最大的转录组差异。ROGUE评估显示神经元在所有细胞类型中纯度最低，且人类神经元细胞类型的细胞间异质性普遍高于猪。
**7. MB神经元在认知记忆功能中的细胞异质性**
与远程记忆相关的基因在小鼠MB各神经元亚型中呈现不同表达模式：c1_Drd2高表达Gpm6a（与突触传递和可塑性相关），c4_PV高表达Pls3（与树突棘密度相关），c5_Tac2高表达Nsf、Stx1b、Syt13和Rab15（与囊泡胞吐相关）。在人MB中，MM4亚簇表现出中脑发育、细胞分解代谢过程和神经递质释放周期的高特征评分，并高表达FOXO3、EXOC4和ARHGAP15（与认知水平相关），提示MM4可能是研究人类认知功能的候选亚群。
**四、讨论与结论**
该研究建立了小鼠、人类和猪MB的跨物种单核转录组图谱，揭示了MB在不同物种中既存在神经元亚型异质性又共享功能潜力的复杂性。小鼠LM神经元中GABAA和GABAB受体表达水平较低及谷氨酸产生相关基因信号较高，可能与其特殊的抑制性突触传递特征及神经退行性疾病中衰老细胞维持相关。细胞间通讯分析提示MM-L神经元可能是MB内的上游旁分泌调节者，LM神经元主要作为信号接收者，并提出了MM-M与LM之间通过MM-L或其他区域建立三维解剖连接的可能性。该研究还发现人和猪MB中可鉴定出小的抑制性神经元簇而小鼠MB中缺乏GABA能中间神经元，提示大脑物种中MB局部抑制性微环路可能更为显著。但这一发现尚不能排除解剖精度、样本量和测序平台等技术支持因素的影响。人类样本仅限于3例老年男性供体，且供体效应在LM亚群中较为明显，限制了该图谱的普适性。总体而言，该研究通过snRNA-seq技术对不同哺乳动物的MB进行了细胞组成和功能特征的表征，并在小鼠中验证了多个神经元亚群的空间定位，揭示了潜在的物种趋同与分化特征，以及MB基因与疾病在转录水平上的关联性。
