LASS2 通过与 THBS1、TFRC 和 APOE 相互作用以抑制 TGF-β1 信号通路和铁死亡，并通过重塑肝细胞脂质分泌组抑制旁分泌肝星状细胞（HSC）的激活，从而减轻肝纤维化

《Cellular Signalling》：LASS2 alleviates liver fibrosis by interacting with THBS1, TFRC, and APOE to inhibit TGF-β1 signaling and ferroptosis, and by reshaping the hepatocyte lipid secretome to suppress paracrine HSC activation

　　

摘要

背景

肝纤维化（LF）缺乏有效疗法。长寿保证同源物 2 (LASS2) 是一种关键的神经酰胺合酶，有助于肝脏稳态，但其在 LF 中的作用尚不清楚。

方法

生物信息学揭示 LASS2 与经典纤维化因素的相关性，并评估了其在纤维化小鼠肝脏和活化 LX-2 细胞中的表达。在体内（肝脏特异性 AAV）和体外（重组腺病毒）进行了功能获得和功能丧失研究，随后进行了表型和机制分析。通过蛋白质组学和免疫共沉淀（co-IP）绘制了蛋白质相互作用图谱，并通过蛋白质 - 蛋白质对接、co-IP/Western blot、免疫荧光共定位和邻近连接实验（PLA）验证了直接相互作用。肝细胞条件培养基（CM）实验结合 ELISA 和靶向脂质组学进行，以剖析 LASS2 介导的旁分泌信号传导。

结果

LASS2 过表达减弱了纤维化发生，以激活依赖的方式调节 mtROS，促进静息和活化肝星状细胞（HSCs）的凋亡，并抑制 EMT。在机制上，LASS2 直接与缩血管素 1 (THBS1)、转铁蛋白受体（TFRC）和载脂蛋白 E (APOE) 相互作用。这些相互作用与抑制 TGF-β1/Smad2/3 信号传导、重塑脂质代谢、协同抑制铁死亡并促进活化 HSCs 凋亡相关，从而减轻肝纤维化。值得注意的是，肝细胞中 LASS2 过表达降低了 CM 中 TGF-β1 的水平并诱导了整体脂质组学重塑，其特征是促纤维化溶血磷脂（LPC/LPE/LPI）、磷脂酸（PA）和神经酰胺（Cer）的下调，以及特定鞘磷脂（SM）和 BMP 种属的上调，创造了抗纤维化的旁分泌环境。

结论

LASS2 充当双重功能的代谢 - 信号整合器：它直接结合 THBS1、TFRC 和 APOE 以控制 TGF-β1 信号传导和铁死亡，同时还重塑肝细胞衍生的旁分泌脂质景观以抑制 HSC 活化。因此，靶向 LASS2 代表了一种有前景的抗纤维化策略。

引言

肝纤维化（LF）是一种病理状况，源于慢性肝病进展过程中的适应性不良伤口愈合反应 [1]，其特征是细胞外基质（ECM）过度合成 [2]、肝星状细胞（HSCs）活化 [3] 以及活性氧（ROS）产生增加 [4]。它不仅是驱动慢性肝病向肝硬化进展的核心病理过程，也是肝硬化和肝细胞癌（HCC）中结构扭曲和功能恶化的根本原因，严重影响这些疾病的预后 [5]，[6]。迄今为止，没有获批的特定疗法能有效逆转或治疗肝纤维化，这使得该领域的研究对于满足关键的未满足临床需求至关重要。肝纤维化并非由单一原因引起；而是环境因素、遗传易感性、免疫反应和细胞信号通路之间复杂相互作用的结果。这种复杂性使其研究极具挑战性，且该过程本身尚未被完全理解。因此，迫切需要更深入地理解肝纤维化的发病机制，以识别能够阻断慢性肝损伤期间纤维化进展的新型治疗靶点，从而防止其严重后果。

在肝脏发病机制背景下，静息 HSCs 发生活化，导致 ECM 成分异常沉积 [7]，[8]。这一活化过程由复杂的调控网络控制。值得注意的是，纤维化和上皮癌共享重叠的细胞和分子特征，包括成纤维细胞和免疫细胞活化、ECM 和 TGF-β 过度产生、氧化应激以及上皮 - 间质转化（EMT）[9]，[10]，[11]。EMT 特别是纤维化发生和肿瘤进展之间的关键机制联系 [11]。经历 EMT 的细胞可以直接合成 ECM 成分，并通过旁分泌信号（特别是通过 TGF-β1）促进 HSC 活化，从而延续纤维化过程 [12]，[13]。例如，人参皂苷 Rg1 已被证明通过抑制 EMT 来减轻肝纤维化 [14]，而端粒功能障碍可能通过 EMT 活化促进纤维化发生 [15]。此外，肝损伤期间产生的 ROS 作为 HSCs 活化的关键驱动因素，促进其向促纤维化表型转变及随后的 ECM 产生 [8]，[16]。ROS 部分通过 TGF-β1/Smad 信号通路促进这一过程 [17]，[18]。此外，ROS 相关的铁死亡在纤维化进展中的作用仍存在争议 [19]，[20]，一些研究表明其具有促纤维化效应 [19]。总的来说，靶向 HSCs 的活化、灭活或调控通路仍然是当前和新兴抗肝纤维化治疗策略的基石。

LAG1 长寿保证同源物 2 (LASS2)，也称为神经酰胺合酶 2 (CerS2)，是神经酰胺合酶家族中的一种必需酶，负责催化长酰基链神经酰胺的产生 [21]。越来越多的证据表明，神经酰胺通过介导凋亡、氧化应激、免疫调节和代谢信号传导，在肝损伤 [22]、修复 [23] 和再生 [24] 的稳态中发挥关键作用。值得注意的是，我们的初步发现表明，LASS2 通过与转铁蛋白受体（TFRC）相互作用调节铁稳态，从而抑制肝癌细胞中的铁死亡，进而抑制 EMT 和 ECM 重塑。此外，LASS2 过表达增强线粒体 ROS (mtROS) 产生。肝癌细胞中 LASS2 相互作用蛋白的蛋白质组学分析进一步揭示了 TGF-β 信号通路中的显著富集，该通路是纤维化和癌症的关键驱动因素。然而，LASS2 是否以及如何参与 LF 仍未被探索。

在本研究中，我们发现 LASS2 在小鼠纤维化肝脏和活化 HSCs 中均下调。利用功能获得和功能丧失实验结合肝细胞条件培养基分析，我们在四氯化碳（CCl?）诱导的 LF 小鼠模型中，以及 HSC 活化和肝细胞 -HSC 串扰中研究了其作用及潜在机制。我们的结果表明，LASS2 通过细胞自主性和肝细胞衍生的旁分泌信号抑制 HSC 活化，这种双重机制促成了其抗纤维化作用。这些结果表明，LASS2 可能作为预防肝纤维化的潜在治疗靶点。

章节摘要

mtROS 的测量

mtROS 测定如前所述进行 [26]。将细胞在室温下用 5 μM MitoSOX Red (Molecular probes, Invitrogen, USA) 预孵育 30 min，收集到 HBSS 缓冲液中，重悬，并立即使用 BD Biosciences 流式细胞仪在激发波长 490–510 nm 和发射波长 570–600 nm 下进行分析。使用 BD FACSDiva 软件 (v8.0.3) 进行数据分析。

LX-2 细胞凋亡分析

使用带有 TRITC 标记 dUTP 的快速一步 TUNEL 试剂盒原位检测凋亡

LASS2 在纤维化小鼠、人类纤维化肝脏和活化 HSCs (LX-2) 中下调

肝纤维化是连接慢性肝病到肝硬化和 HCC 的关键病理过程。为了检查 LASS2 在此谱系中的转录作用，我们在纤维化阶段和 HCC 阶段进行了比较转录组分析。GSE84044 数据集（HBV 相关纤维化/肝硬化）用于代表纤维化阶段，TCGA-LIHC 中的 HCC 肿瘤组织用于代表癌症终点。这种两点比较评估了 LASS2 表达及其

讨论

肝纤维化（LF）是一种多因素病理过程，尽管进行了广泛的临床前努力，但有效疗法仍然有限 [6]，[27]。这凸显了需要具有明确分子机制的治疗靶点。在此，我们确定 LASS2 是这一过程的关键内源性抑制因子。

其在 CCl? 诱导的纤维化小鼠肝脏和 TGF-β1 活化的人 LX-2 细胞中均显著下调。人类数据强化了这一模式。在 HBV 相关

结论

本研究确定了 LASS2 以前未被认识的抗纤维化作用，通过细胞自主性和非细胞自主性机制发挥作用。在 HSCs 中，LASS2 通过直接与 THBS1、TFRC 和 APOE 相互作用，减弱 TGF-β1/SMAD 信号传导和 pEMT，同时限制铁死亡相关的纤维化发生。在肝细胞中，LASS2 重塑分泌组，减少驱动 HSC 活化的促纤维化介质的释放。这种肝细胞 -HSC 旁分泌轴在体内的相关性以及

CRediT 作者贡献声明

余荣景：软件，调查，形式分析，数据整理。李晓雨：验证，软件，调查，形式分析，数据整理。黄云飞：验证，软件，调查，数据整理。余云燕：验证，软件，调查。凌东：软件，调查，数据整理。赵丽：验证，调查。杨晓莉：验证，软件。侯泽宇：监督，资源，资金获取。罗毅：资源，资金获取。陈茹：

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：陈茹报告获得了贵州省科学技术厅的财政支持。赵雨洁报告获得了遵义市科学技术局的财政支持。罗毅报告获得了遵义市科学技术局的财政支持。侯泽宇报告获得了遵义市科学

致谢

本工作得到了 贵州省科技计划项目 (黔科合基础 ZK [2022] 640)，遵义市科技计划项目 (遵义科合基 HZ [2023] 260, HZ [2024]204, HZ [2024]193) 的支持。

余荣景 |李晓雨 |黄云飞 |余云燕 |凌东 |赵丽 |杨晓莉 |侯泽宇 |罗毅 |陈茹 |赵雨洁 |杨燕

中国贵州省遵义市遵义医学院附属医院检验医学科