Src酪氨酸激酶介导锌离子（Zn2+）诱导的心肌保护作用，从而对抗内质网应激以及缺血/再灌注损伤

《Cellular Signalling》：Src tyrosine kinase mediates Zn2+-induced myocardial protection against endoplasmic reticulum stress and ischemia/reperfusion injury

　　

摘要

目的

本研究旨在探讨Src酪氨酸激酶在Zn²⁺诱导的心脏保护中的作用，以及涉及内质网应激（ERS）、线粒体功能障碍和线粒体钙调节的机制。

方法

使用H9c2细胞建立缺血/再灌注（I/R）损伤和ERS的体外模型。通过MTT/CCK-8检测和乳酸脱氢酶释放来评估细胞活力和细胞毒性。通过共免疫沉淀实验检测Src与MCU及Mfn1/Mfn2的相互作用。利用Western blotting技术检测Src的磷酸化、MCU复合体成分、CaMKIIδ/CREB信号蛋白及ERS标志物。通过共聚焦显微镜观察线粒体膜电位、Zn²⁺和Ca²⁺水平以及活性氧的生成。

结果

在2-DG/TM处理过的H9c2细胞中，GRP78/94表达增加，细胞活力下降，Src磷酸化受到抑制，细胞内和线粒体内的Zn²⁺水平降低。这些变化伴随着线粒体膜电位丢失、mPTP开放、Ca²⁺超载和ROS积累。外源性Zn²⁺可以逆转这些效应，而PP2或Src siRNA则会破坏其保护作用。在I/R模型中，Zn²⁺提高了细胞活力，减少了LDH的释放，恢复了Zn²⁺的稳态，并减轻了Ca²⁺超载。I/R处理降低了p-Src（Tyr416）和MCUb的表达，同时增加了CaMKIIδ、MCU、MICU1、MICU2和p-CREB（Ser133）的表达。这些改变可被Zn²⁺逆转，但PP2会减弱其效果。

结论

Zn²⁺通过Src依赖的机制保护H9c2细胞免受ERS和I/R损伤。活化的Src与Mfn1/Mfn2相关，并在ERS过程中维持线粒体功能。此外，Zn²⁺通过激活Src调节CaMKIIδ/CREB/MCU通路，从而减少线粒体Ca²⁺超载、mPTP开放、ROS积累和I/R引起的心肌细胞损伤。

引言

急性心肌梗死（AMI）是一种严重的心血管疾病，最有效的治疗方法是通过血管重建迅速恢复冠状动脉血流。然而，这种治疗可能会反倒引发心肌缺血/再灌注损伤（MI/RI），导致额外的组织损伤、心脏功能障碍加重，甚至出现危及生命的心律失常[1]。因此，阐明MI/RI的机制并确定有效的治疗策略对于改善动脉粥样硬化患者的预后至关重要。

Zn²⁺的稳态在保护免受MI/RI方面起着关键作用。先前的研究表明，Zn²⁺具有对抗MI/RI的心脏保护作用[2] [3]。因此，维持细胞内Zn²⁺的平衡对心血管健康至关重要。在心肌再灌注过程中，细胞内Zn²⁺水平显著下降，这可能触发ERS并促进线粒体通透性转变孔（mPTP）的开放，从而加重心肌梗死并增加再次梗死的风险[4]。我们的早期研究表明，MI/RI期间Zn²⁺的耗竭会诱导ERS，进而通过线粒体相关内质网膜（MAMs）调节线粒体钙离子转运蛋白（MCU）。这一过程会导致线粒体Ca²⁺超载、mPTP开放，最终导致细胞死亡[5]。

Zn²⁺调节Ca²⁺的稳态并抑制MCU-mPTP活性。它下调ERS标志物蛋白（包括葡萄糖调节蛋白78/94（GRP78/94），并抑制细胞内Ca²⁺的积累和线粒体活性氧（ROS）的产生。这些作用最终抑制心肌细胞中的ERS并提供心脏保护[6]。线粒体钙离子转运蛋白（MCU）位于线粒体内膜，是一种高选择性的Ca²⁺通道，负责将Ca²⁺转运到线粒体基质中。高效的线粒体Ca²⁺转运依赖于MCU复合体的协同作用，该复合体由形成孔道的MCU蛋白和几个调节亚基组成，包括线粒体钙离子转运蛋白1/2（MICU1/2）、主要负性线粒体钙离子转运亚基b（MCUb）以及必需的MCU调节因子（EMRE）[7]。除了MCU复合体外，Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II delta（CaMKIIδ）也被证明是通过调节MCU活性和线粒体Ca²⁺内流来调节线粒体Ca²⁺稳态的重要因子。这种主要的 cardiac CaMKIIδ异构体已被证实会在缺血/再灌注（I/R）过程中促进心肌损伤。抑制CaMKIIδ可以通过调节MCU表达来减轻这种损伤。具体来说，CaMKIIδ通过环腺苷单磷酸反应元件结合蛋白（CREB）增强MCU的转录，增加MCU复合体的数量并提高线粒体Ca²⁺的摄取[8]。我们最近的研究进一步表明，Zn²⁺通过调节MCU复合体来改善H9c2心肌细胞的I/R损伤[9]。然而，Zn²⁺是否通过CaMKIIδ调节MCU复合体来实现这种心脏保护作用尚不清楚。

Src酪氨酸激酶是一种与膜相关的非受体酪氨酸激酶，在心血管信号传导中起关键作用，通过调节细胞存活、凋亡、氧化应激和细胞损伤的适应反应来发挥作用。它调节细胞内信号传导，并参与多种细胞过程，包括细胞周期和凋亡[10]。在中脑动脉阻塞引起的大脑I/R损伤中，磷酸化的Src（p-Src）作为CaMKII磷酸化的上游调节因子，促进线粒体Ca²⁺的摄取[11]。此外，研究显示白藜芦醇可以通过Zn²⁺发挥心肌保护作用[4]，并通过调节Src酪氨酸激酶来减轻炎症反应[12]，表明Zn²⁺和Src酪氨酸激酶之间可能存在相互作用。我们的先前研究还表明，Zn²⁺调节线粒体Src活性，抑制线粒体复合体I，减少ROS的产生，并缓解MI/RI[13]。我们研究了Zn²⁺是否通过调节MI/RI中的Src酪氨酸激酶来调节MCU复合体。尽管有这些发现，Src酪氨酸激酶在MI/RI中的作用仍不完全清楚。

线粒体融合对于维持线粒体形态、生物能量功能和细胞稳态至关重要。这一过程主要由mitofusin 1（Mfn1）、mitofusin 2（Mfn2）和optic atrophy 1（OPA1）介导。新兴证据表明，ROS通过SIRT1信号通路调节Mfn1/Mfn2的表达，从而影响线粒体的动态和功能[14]。然而，目前尚不清楚Zn²⁺是否通过Src酪氨酸激酶依赖的信号通路调节Mfn1和Mfn2，从而在MI/RI损伤期间减轻线粒体功能障碍和ROS的产生。因此，本研究旨在阐明Src酪氨酸激酶是否介导Zn²⁺对H9c2细胞中ERS和I/R损伤的保护作用。具体而言，我们研究了Src是否通过线粒体融合蛋白Mfn1/Mfn2调节线粒体动态，并通过CaMKIIδ/CREB/MCU信号通路调节线粒体Ca²⁺的稳态。通过结合药物抑制和siRNA沉默Src，我们进一步明确了Src依赖性信号通路在Zn²⁺介导的ERS抑制、线粒体功能保护、线粒体Ca²⁺超载减轻以及氧化应激减缓和I/R引起的心肌细胞损伤中的作用。

节选

化学试剂

根据先前的研究，1-羟基吡啶-2-硫酮锌盐（H6377-10G，Sigma-Aldrich）溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，作为外源性Zn²⁺的来源[5]。

细胞培养

H9c2心肌细胞来源于美国弗吉尼亚州马纳萨斯市的American Type Culture Collection（ATCC）。细胞在添加了10%胎牛血清（Life-iLab，中国）和1%青霉素-链霉素（Beyotime，中国）的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）中培养和传代。

Zn²⁺参与Src介导的2-DG/TM诱导的内质网应激的减轻

为了确定Src信号通路是否参与了Zn²⁺对ERS的保护作用，用Src抑制剂PP2处理H9c2细胞。CCK-8检测显示2-DG显著降低了细胞活力，而Zn²⁺预处理显著减轻了这种降低。PP2显著消除了Zn²⁺的保护作用，表明Src的激活是Zn²⁺维持细胞活力的必要条件（图1A）。Western blot分析也证实了这一点。

讨论

Zn²⁺作为细胞内第二信使和必需的微量元素，调节基本的细胞功能。它对蛋白质合成、能量代谢和抗氧化防御至关重要，并且是许多酶和转录因子的结构和功能组成部分[15] [16]。通过协调抗氧化、抗炎和抗凋亡信号通路，Zn²⁺在维持心肌细胞膜完整性和保护线粒体方面起着核心作用

结论

如示意图（图7）所示，Zn²⁺通过Src依赖的机制保护H9c2细胞免受ERS和I/R损伤。在ERS条件下，Zn²⁺介导的Src激活与线粒体融合相关蛋白Mfn1和Mfn2的调节有关，并在I/R损伤期间调节CaMKIIδ/CREB/MCU信号通路。这些协同作用有助于维持细胞内和线粒体内的Zn²⁺和Ca²⁺稳态，以及抑制ROS的产生

CRediT作者贡献声明

李晓宇：撰写——初稿，概念构思。傅宇：正式分析，数据管理，概念构思。沈志佳：资源提供，概念构思。王秋瑜：监督，软件使用。陈曦：方法学，实验设计。邢博瀚：可视化，方法学。黄鲁尧：正式分析。薛子阳：方法学。郑焕：项目管理。何永贵：监督，项目管理。习金坤：撰写——审稿与编辑，项目管理，概念构思。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号82270303）和河北省自然科学基金（编号H2024209078、H2026209083）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

李晓宇|傅宇|沈志佳|王秋瑜|陈曦|邢博瀚|黄鲁尧|薛子阳|郑焕|何永贵|习金坤

华北科技大学基础医学院，河北慢性疾病重点实验室，唐山063210，中国