一种新型的、构象受限的、基于RGD（RGD肽）的环状肽，靶向整合素αvβ6蛋白，用于抗肿瘤治疗应用

《Chemico-Biological Interactions》：A novel conformationally constrained RGD-based cyclic peptide targeting integrin αvβ6 protein for antitumor therapeutic applications

　　

摘要

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽序列在细胞外基质蛋白中广泛存在，能够高效靶向肿瘤细胞表面过度表达的整合素受体，从而促进治疗分子向肿瘤组织的选择性递送。环状RGD肽因相对于线性RGD肽具有更高的靶点亲和力而受到广泛认可，许多基于RGD的肽已在临床试验中进行评估。在这项研究中，我们报道了一种含有构象约束异靛哚酮骨架的新型环状RGD肽的合成和生物活性。该环肽通过分子内光诱导单电子转移环化反应制备，其绝对构型通过实验和理论电子圆二色性（ECD）分析得到明确确定。我们还利用药效团映射（TargetNet）结合反向分子对接（GalaxySagittarius-AF）系统性地筛选了该肽的潜在靶点，结果显示合成环肽对整合素αvβ6受体具有高亲和力。这一发现通过实验性生物层干涉测量以及分子对接和分子动力学模拟得到了进一步验证。全面的体外和体内生物学评估表明，该环肽能有效抑制肿瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡和自噬。

引言

传统的肿瘤治疗方法依赖于破坏癌细胞和组织，往往伴随着显著的副作用。开发能够选择性靶向并消除肿瘤细胞同时尽量减少不良反应的抗肿瘤药物已成为肿瘤学中的一个主要挑战。整合素在肿瘤细胞表面高度表达，并通过与细胞外基质（ECM）蛋白的相互作用在肿瘤侵袭和转移中起关键作用^[1]。随着癌症研究的进步，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）肽已被证实是整合素-配体相互作用的竞争性和持久性抑制剂^[1]，显示出作为有效抗肿瘤治疗药物的巨大潜力。大量研究证明，RGD肽不仅能与表达整合素的细胞竞争性结合，从而抑制肿瘤细胞黏附和转移，还能直接诱导肿瘤细胞凋亡^[4]。这些特性有助于减少脱靶效应，并提高疾病检测和监测的能力。因此，RGD肽及其衍生物和纳米颗粒在靶向药物递送和分子成像方面具有巨大应用前景^[6]。

线性RGD肽容易被体内的蛋白酶降解^[7]，且大多数线性RGD肽的循环半衰期较短，导致治疗效果不佳和生物活性有限^[8]。要达到满意的抗肿瘤效果通常需要高剂量的含RGD的线性肽，这不仅会增加治疗成本，还会增加不必要的不良反应风险^[9]。与线性RGD肽相比，环状RGD肽具有更稳定的结构构象，对整合素受体的结合亲和力和选择性更好^[10]。因此，设计和构建环状RGD肽以提高其稳定性和改善生物应用是开发基于RGD的治疗药物的关键目标。

酰胺键介导的环化是一种常用的构建环状RGD肽的方法。该方法涉及在线性肽前体的C末端羧基和N末端氨基之间形成酰胺键。典型的例子包括cyclo(RGDfK)和cyclo(RGDfV)，它们因具有更好的生物稳定性和整合素结合亲和力而受到广泛研究^[11]。得益于端到端酰胺环化形成的刚性环状骨架，这两种肽对蛋白酶水解的酶稳定性显著提高，对肿瘤特异性整合素的结合亲和力也大大增强^{[10][13]。与酰胺键结合的环状RGD肽（如cyclo(RGDfK)和cyclo(RGDfV)相比，二硫键环化的RGD肽在合成简便性、环化条件温和性以及在肿瘤微环境中可逆的氧化还原响应性方面具有独特优势[14]。然而，这也带来了一些不可忽视的缺点，例如在体内的稳定性差和化学性质不稳定。二硫键的形成增强了小分子RGD肽的构象刚性，使其对整合素αvβ6的结合亲和力显著提高[14]。此外，Yoon等人[15]开发了一种分子内光诱导单电子转移（SET）环化方法来制备环肽。该方法使用邻苯二甲酰亚胺作为电子受体，携带三甲基硅基离去基团的肽链作为电子供体，从而构建一个分子内供体-受体系统[16],[17]。光照激发后，双端自由基迅速生成并在三甲基硅基消除后高效偶联，生成所需的环状产物（方案1）。在此光环化过程中，刚性异靛哚酮单元的引入通过空间位阻限制了肽的构象。这些结构和机制优势激发了我们利用基于SET的环化方法来修饰RGD肽以开发新型构象约束抗肿瘤剂的研究兴趣。}

在本文中，我们设计并制备了一种含有刚性异靛哚酮的新型环状RGD肽，使用基于SET的环化反应来研究这种环状肽的潜力。Fmoc-L-精氨酸、Fmoc-L-甘氨酸和Fmoc-L-天冬氨酸-4-烯丙基酯被用作构建块，2-氯三苯甲基氯树脂作为固相合成支持剂。首先通过固相肽合成法合成线性RGD肽，然后分别用N-[(三甲硅基)甲基]苯胺（BnTMSA）和邻苯二甲酰基葡萄糖苷氯对RGD序列的N端和C端进行功能化。利用我们之前的工作中开发的光诱导单电子转移（SET）反应^[18]，光照引发肽链中的三甲基硅基断裂，使整个肽能够作为电子供体并与邻苯二甲酰基葡萄糖苷部分进行分子内环化，从而生成目标环状RGD肽。所得化合物通过实验和理论电子圆二色性（ECD）分析进行了全面的结构表征^[19]。这种方法在难以获得小分子单晶时常用于立体化学研究。通过AI驱动的药效团映射（TargetNet）^[20]结合反向分子对接（GalaxySagittarius-AF）^[21]系统性地筛选了该环状RGD肽的潜在靶点，预测其对整合素αvβ6受体具有强结合亲和力。实验验证采用无标记的实时光学生物传感技术——生物层干涉测量（BLI）^[22]，定量评估了设计环肽与预测靶蛋白之间的相互作用。这些结果通过分子对接和分子动力学模拟得到了进一步证实。全面的体外和体内生物学评估表明，该环肽能有效抑制肿瘤细胞增殖，并诱导细胞凋亡和自噬。

节摘

材料

Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg (Tos)-OH、Fmoc-L-天冬氨酸 a-烯丙基酯（Fmoc-Nα-Fmoc-Nω-tosyl-L-精氨酸 (Asp (OAll)-OH）、二异丙基乙胺（DIEA）、4-二甲胺吡啶（DMAP）、O-苯并三唑-1-基-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、N-[(三甲硅基)甲基]苯胺（BnTMSA）、邻苯二甲酰氯和三氟乙酸（TFA）均从Energy Chemical公司购买。二甲甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、甲醇（MeOH）、乙酸乙酯、石油醚和1,4-二恶烷也从相同公司购买。

合成

目标环肽通过三步策略合成：首先在2-氯三苯甲基氯（2-CTC）树脂上进行线性肽前体的固相组装，然后引入具有环化活性的功能基团，最后进行光诱导单电子转移（SET）环化。简要来说，线性肽前体是使用标准的Fmoc基固相肽合成（SPPS）方法构建的。

结论

肿瘤靶向治疗正逐渐成为抗击癌症的关键方法。靶向肽是专门设计用于靶向肿瘤细胞和组织的肽，RGD肽就是其中的一个例子。在本研究中，我们利用分子内光诱导单电子转移环化反应设计并合成了含有RGD序列和C-3位置S构型的环状肽化合物1。体内生物学实验表明，

注释

作者声明没有竞争性财务利益关系。

CRediT作者贡献声明

江泽炎：研究。赵思萌：研究。张洪瑞：研究。王志强：写作-审稿与编辑、监督、项目管理、概念化。李婷婷：研究。吴晓丹：项目管理。曲春宇：写作-初稿、方法学、研究、数据管理。雷月：研究。吕阳：写作-初稿、方法学、研究、数据管理

未引用的参考文献

[2], [3], [5], [12], [23], [25], [27], [29]。

利益声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系会影响本文报告的工作。

资金来源

本研究的资金支持来自黑龙江省自然科学基金的人才培养项目（PL2025H222，以及哈尔滨师范大学的研究生创新项目（HSDSSCX2025-26）。

竞争利益声明

作者声明没有已知的竞争性利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

理论计算是在中国科学研究院计算机网络信息中心的ScGrid和Deepcomp7000系统上进行的。我们还感谢哈尔滨师范大学的高性能计算中心提供的支持。

吕阳|曲春宇|雷月|张洪瑞|江泽炎|赵思萌|李婷婷|吴晓丹|王志强

哈尔滨师范大学化学与化学工程学院光子与电子带隙材料重点实验室，中国哈尔滨，150025