皮立霉素通过激活小鼠CREB-BDNF轴对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用

《Chemico-Biological Interactions》：Plicamycin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury by activating the CREB-BDNF axis in mice

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摘要

普利霉素（PLI）是一种小分子金丝桃霉素酸类抗生素，自20世纪70年代起已被批准用于癌症治疗。然而，其在心肌缺血再灌注损伤（MIRI）过程中与心血管生物系统的相互作用尚不清楚。本研究在小鼠MIRI模型中考察了其心脏保护作用以及与cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和脑源性神经营养因子（BDNF）相关的机制。在心脏缺血再灌注前7天，以150 μg/kg/天的剂量腹腔注射PLI给药于小鼠，可减轻心肌梗死面积的增加以及血清肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）水平的升高。PLI还改善了MIRI小鼠的心脏功能，表现为更高的射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）值。生化分析和二氢乙啉（DHE）染色分析表明，PLI给药可防止再灌注后缺血心肌内氧化应激失衡。PLI还通过下调caspase-3、caspase-9和Bax的表达，同时上调Bcl-2的表达，防止缺血心肌组织内心肌细胞的凋亡。进一步研究表明，缺血再灌注（I/R）损伤降低了缺血心肌内磷酸化CREB和BDNF的表达水平，而PLI可防止这一降低。更重要的是，通过666-15（10 mg/kg/天）药理学抑制CREB或通过K252a（25 μg/kg/天）抑制BDNF信号通路，可减弱PLI的心脏保护作用。总之，我们的数据表明PLI通过激活CREB-BDNF信号通路，同时抑制氮氧应激，防止I/R引起的心脏损伤。

引言

心血管疾病，特别是缺血性心脏病，近年来给全球医疗系统带来了严重负担[1]。在这些疾病中，急性心肌梗死（AMI）仍然是关键的临床急症。经皮冠状动脉介入术（PCI）仍然是AMI的标准治疗策略，因为它能迅速恢复冠状动脉血流，从而减轻缺血性损伤[2]。然而，急性血流的恢复往往引发心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）。MIRI显著增加了受影响患者的不良长期预后和死亡率3, 4, 5。尽管针对MIRI的干预措施已进行了大量研究，但目前的临床策略仍不足以有效阻止一旦启动的心肌细胞死亡级联反应[6]。MIRI涉及多种病理机制，包括氧化应激、炎症激活和线粒体功能障碍。其中，氧化应激和细胞凋亡是两个在整个再灌注损伤过程中持续存在的核心病理过程。两者均与钙稳态失衡和线粒体损伤密切相关，共同推动MIRI的进展7, 8, 9。因此，识别能够减轻氧化应激和心肌细胞凋亡以减少再灌注损伤的药物具有迫切的临床需求。

普利霉素（PLI）属于金丝桃霉素酸类抗肿瘤抗生素，可破坏富含GC的DNA序列与特异性蛋白1（Sp1）之间的相互作用10, 11。临床上，PLI已作为抗肿瘤药物用于睾丸胚胎性癌、肿瘤相关性高钙血症和髓样白血病的长期治疗12, 13, 14。近年来，越来越多的证据表明PLI在心血管疾病中也可能发挥关键作用。PLI可下调聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）的表达，从而减轻H9c2心肌细胞中缺氧诱导的凋亡[15]。在血管紧张素II介导的心肌损伤模型中，PLI通过抑制Sp1活性阻断细胞外调节激酶（ERK）信号通路，从而减轻心肌纤维化重塑[16]。此外，PLI已被证明可抑制Sp1与PARP-1之间的相互作用，从而阻断促凋亡因子Nix的转录，减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤[17]。综上所述，现有证据表明PLI可能通过调节转录反应发挥心脏保护作用。然而，PLI能否直接减轻MIRI尚不清楚。

cAMP反应元件结合蛋白（CREB）是一种关键的转录因子，在各种应激条件下发挥神经保护作用并调节细胞存活18, 19。最近的报道表明，激活的CREB可促进与抗氧化应激和促存活信号相关的基因转录，抑制心肌细胞凋亡，并有助于心血管保护20, 21, 22。在MIRI模型中，磷酸化CREB受ERK信号通路的正向调节，促进线粒体自噬并减少心肌细胞凋亡，从而减小梗死面积[22]。此外，在持续性β肾上腺素能受体刺激驱动的病理性心脏重塑模型中，磷酸化CREB上调线粒体Ca²⁺单向转运蛋白的转录，维持线粒体钙稳态，抑制心肌肥大，限制不良重塑[23]。值得注意的是，研究人员还发现CREB基因敲除小鼠通常在2至20周龄时发展为扩张型心肌病，导致死亡率显著增加[24]。

脑源性神经营养因子（BDNF）由CREB经典调控，可促进神经发生、保护神经元并调节突触可塑性25, 26。磷酸化CREB通过结合其启动子区域激活BDNF的转录。越来越多的证据表明BDNF可能通过多种机制在心血管疾病中发挥心脏保护作用。在心肌梗死中，BDNF通过调节瞬时受体电位经典通道3/6（TRPC3/6）减轻损伤并减少啮齿动物的心肌细胞凋亡[27]。它还通过中枢神经系统介导的途径改善梗死后损伤和心脏功能障碍[28]。在心力衰竭模型中，BDNF通过激活酪氨酸受体激酶B（TrkB）及相关通路，减少心肌细胞凋亡和纤维化，从而减缓小鼠梗死后心力衰竭的进展[29]。此外，BDNF与碱性成纤维细胞生长因子的联合应用可增强缺血心肌的血管新生和心脏功能[30]。

这些发现表明CREB及其下游靶标BDNF在心脏应激损伤期间均具有保护作用；然而，CREB-BDNF信号轴在I/R期间的具体影响仍定义不清。因此，我们建立了小鼠MIRI模型，以研究PLI对缺血心肌内氧化应激和凋亡的影响。本研究还进一步探讨了CREB-BDNF轴在I/R过程中介导PLI心脏保护作用中的潜在参与。

章节片段

动物

雄性C57BL/6J小鼠（8–10周龄，22–26 g）购自济慈药康（中国南京），在实验前于受控实验室条件下适应7天，光照-黑暗周期为12小时，温度23 ± 1°C，相对湿度50 ± 10%，每笼饲养5只，自由采食和饮水。所有程序的伦理批准由南通大学伦理委员会授予（编号：2110836），且

I/R小鼠中PLI的剂量选择

为确定PLI的合适剂量，我们测量了实验小鼠的血清LDH、H₂O₂和CK。I/R小鼠分别以50、100、150或200 μg/kg/天的剂量预治疗PLI。I/R后所有三个指标均升高，并被PLI以剂量依赖性方式降低（LDH：图1A，F_5,24 = 169.70，p < 0.01；H₂O₂：图1B，F_5,24 = 86.03，p < 0.01；CK：图1C，F_5,24 = 167.20，p < 0.01）。从50到150 μg/kg/天剂量时降低效果递增，随后达到平台期，因为200 μg/kg/天剂量时的值未

抑制BDNF信号可逆转I/R后7天PLI介导的心脏功能改善和纤维化减轻

在再灌注后7天，双因素方差分析显示PLI处理（EF：F_1,16 = 27.43，p < 0.01；FS：F_1,16 = 54.33，p < 0.01）、K252a处理（EF：F_1,16 = 21.02，p < 0.01；FS：F_1,16 = 28.71，p < 0.01）及其交互作用（EF：F_1,16 = 16.07，p < 0.01；FS：F_1,16 = 29.25，p < 0.01）均具有显著效应（图13A–C）。事后分析表明K252a显著逆转了PLI介导的EF和FS改善（图13A–C）。对于纤维化面积，PLI

讨论

MIRI导致额外的心肌细胞死亡和心脏功能障碍；因此，MIRI的有效药物治疗仍有迫切的临床需求42, 43, 44, 45。PLI此前用于治疗高钙血症和某些癌症。尽管其系统性毒性限制了大剂量的临床应用，但近期研究表明在特定疾病情境下，在控制剂量的条件下，PLI仍保留靶向的药理学活性，提示其潜在

结论

本研究证明，PLI作为MIRI心脏生化反应的小分子调节剂，在I/R小鼠中具有心脏保护作用，表现为心脏功能改善、梗死面积减小、氧化应激减轻和心肌细胞凋亡受抑。我们的数据还表明PLI的保护作用至少部分通过CREB-BDNF信号轴介导。这些结果将PLI确定为MIRI治疗的有前景候选药物，且CREB-BDNF轴可能

CRediT作者贡献声明

Tianchen Xia（夏天辰）：写作 – 审阅与编辑、方法学、调查。Weijing Wang（王伟靖）：方法学、调查。Boyu Xia（夏伯宇）：方法学、调查。Qi Li（李琪）：写作 – 审阅与编辑、方法学、调查。Le Yin（尹乐）：方法学。Chao Huang（黄超）：调查、资金支持。Qingsheng You（尤清升）：写作 – 审阅与编辑、概念化。xiaomei yuan（袁小美）：写作 – 审阅与编辑、写作 – 原创草稿、监督、概念化

未引用参考文献

52.; 64..

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获南通大学伦理委员会批准。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

数据可用性

数据应要求提供。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

无。

Tianchen Xia（夏天辰）|Weijing Wang（王伟靖）|Boyu Xia（夏伯宇）|Qi Li（李琪）|Le Yin（尹乐）|Chao Huang（黄超）|Qingsheng You（尤清升）|Xiaomei Yuan（袁小美）

南通大学附属医院心胸外科，江苏南通226001，中国

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