载白藜芦醇PLGA纳米颗粒的表面糖基化调控其与B淋巴细胞的界面相互作用

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Surface glycosylation of resveratrol-loaded PLGA nanoparticles modulates interfacial interactions with B lymphocytes

　　

• PLGA 通过碳二亚胺与甘露糖胺和半乳糖胺进行了糖基化。
• 功能化产生了胶体稳定的 PLGA 纳米颗粒。
• PLGA–GAL 纳米颗粒显示出与 B 淋巴细胞最高的相互作用。
• 所有纳米颗粒均表现出高生物相容性，无膜损伤。
• 负载白藜芦醇的纳米颗粒减弱了 B 细胞活化并调节分化。

引言
B 淋巴细胞在免疫稳态中发挥双重作用，不仅作为抗体产生细胞，还作为抗原呈递细胞和细胞因子分泌调节适应性免疫 [4]，使其成为治疗调节的相关靶点。通过 B 细胞受体 (BCR) 信号传导、共刺激相互作用和细胞因子产生（例如 IL-6、TNF-α 和 IL-10），B 细胞主动调节 T 细胞活化和炎症反应。然而，B 淋巴细胞的持续失调在疾病发病机制中起关键作用 [1], [2]。这些细胞群激活、信号传导和调节的改变促进了持续细胞因子产生、免疫耐受丧失和进行性组织损伤 [2], [3]。这种失调促成了慢性炎症和自身免疫疾病的发病机制，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和炎症性肠病，其中自身反应性 B 细胞促进慢性炎症和组织损伤 [5]。

鉴于它们在免疫调节和疾病进展中的核心作用，B 细胞已成为免疫介导疾病中有吸引力的治疗靶点。尽管传统的免疫抑制疗法仍然是主要的治疗手段，但它们缺乏细胞选择性以及频繁发生的系统性不良反应限制了长期使用，突显了开发更特异性和更安全的治疗策略的必要性，特别是那些能够在纳米尺度上调节细胞 - 材料相互作用的策略 [6], [7]。

具有免疫调节活性的天然化合物作为传统免疫抑制剂的替代品受到了越来越多的关注 [8], [9]。其中，天然存在的多酚化合物反式白藜芦醇已被证明能够调节关键炎症通路并调节髓系和淋巴系细胞群的功能 [10], [11]。然而，其低稳定性、差水溶性、低生物利用度和快速代谢严重限制了其治疗应用；这种限制阻碍了与靶细胞的有效相互作用，并显著降低了其治疗效果 [12], [13]。在这方面，将白藜芦醇封装在聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 纳米颗粒内代表了一种有前景的策略，以保护该化合物，延长其生物可利用性，并促进控制递送 [14]。

为了克服这些药代动力学局限性并增强细胞选择性，基于纳米技术的药物递送系统已成为能够改善生物活性化合物稳定性、生物利用度和释放特性的平台 [15], [16]。在这些系统中，聚合物纳米颗粒因其结构多样性以及调节物理化学性质（如颗粒大小、表面电荷和疏水性）的可能性而被广泛研究，这些参数直接影响生物分布和细胞相互作用，特别是通过纳米颗粒 - 细胞界面过程 [17], [18]。在可生物降解聚合物中，PLGA 因其生物相容性、可生物降解性和经批准的生物医学应用而脱颖而出，使其成为设计控制药物递送系统的有吸引力平台 [19], [20], [21]。

这些系统的性能很大程度上取决于对其物理化学性质的严格控制，如颗粒大小、多分散指数和表面电荷，因为这些参数决定了胶体稳定性和细胞内化途径。这些相互作用从根本上受界面现象支配，其中纳米颗粒表面性质决定与细胞膜和膜相关受体的直接相互作用，影响细胞识别和内化机制 [22], [23]。这对应于被动靶向，由影响生物分布和与细胞非特异性相互作用的物理化学性质驱动。在制备聚合物纳米颗粒的可用技术中，纳米沉淀法已确立为一种简单且可重现的策略，能够生产主要为球形、尺寸均匀且具有适合生物应用特性的颗粒 [24], [25], [26]。

除了药物封装外，纳米颗粒与靶细胞之间的选择性相互作用构成了增强治疗效果的关键方面 [27], [28]。相反，主动靶向依赖于细胞水平的配体介导的、受体特异性识别。用靶向配体进行表面功能化使纳米载体能够主动导向特定细胞群。

在多种靶向配体类别中，基于碳水化合物的策略因其能够修饰纳米颗粒表面化学并促进与免疫细胞上表达的内源性凝集素受体的特异性相互作用而显得特别有吸引力。碳水化合物配体提供固有的物理化学和免疫学优势。单糖体积小、化学稳定、合成可获得，与基于蛋白质的配体相比表现出低免疫原性潜力 [29]。

在分子水平上，糖纳米颗粒在其表面显示多个碳水化合物配体，增加局部配体密度并通过糖簇效应增强凝集素结合，从而调节纳米颗粒 - 细胞界面识别。这种较高的表面密度增强了原本微弱的碳水化合物 - 凝集素相互作用。这种展示类似于天然糖萼介导的识别过程，并可以促进受体介导的内化 [30]。

碳水化合物介导的靶向已被研究以促进纳米载体与髓系细胞之间的相互作用，这些细胞表达多种参与病原体识别和内吞的凝集素受体。例如，甘露糖胺或半乳糖胺功能化纳米颗粒已通过 C 型凝集素受体和参与抗原内化和免疫调节的相关凝集素，展示了增强的树突状细胞和巨噬细胞摄取 [31], [32], [33], [34], [35]。在疫苗导向平台中，PLGA 纳米颗粒的半乳糖残基糖基化显著增加了树突状细胞摄取，促进了成熟标记物的表达，并与非糖基化制剂相比改善了脾脏积累 [36]。已证明这些系统能增强抗原呈递和随后的适应性免疫反应激活。

尽管取得了这些进展，大多数基于碳水化合物的靶向策略主要集中于髓系区室的抗原呈递细胞。相反，碳水化合物功能化纳米载体与淋巴系群体，特别是 B 淋巴细胞之间的潜在相互作用尚未得到充分探索。考虑到 B 细胞在抗体产生和调节适应性免疫反应中的核心作用，了解碳水化合物功能化纳米颗粒平台如何与这些细胞相互作用代表了开发新免疫调节策略的一个有前景的机会。

在这种情况下，本研究侧重于开发用单糖甘露糖胺和半乳糖胺功能化的 PLGA 纳米颗粒。该工作研究了表面糖基化如何影响所得纳米颗粒的物理化学性质，并检查它们与外周血单个核细胞 (PBMC) 亚群的相互作用。关注不同免疫群体的细胞反应，突出了在 B 淋巴细胞中观察到的相关相互作用。此外，该系统被评估作为免疫调节化合物反式白藜芦醇的载体，提供了一个平台来探索糖基化聚合物纳米颗粒如何与免疫细胞相互作用。

部分片段

试剂
聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) Resomer? RG 503 H (50:50, 酸端基，M?w: 24,000-38,000 g/mol) 和 PLGA Resomer? RG 752 H (75:25, 酸端基，M?w: 4,000-15,000 g/mol) 购自 Sigma-Aldrich (德国)。N-羟基磺基琥珀酰亚胺 (sulfo-NHS)、N,N′-二环己基碳二亚胺 (DCC, 96%)、4-(二甲氨基) 吡啶 (DMAP, 95%) 和乙二胺 (EDA) 购自 Sigma-Aldrich (德国 Steinheim)。二氯甲烷 (DCM)、二甲基甲酰胺 (DMF)、氯仿

PLGA 单糖偶联物
傅里叶变换红外光谱分析 (图 2 和补充图 S1) 允许鉴定基础聚合物的特征带以及单糖偶联产生的化学修饰。与甘露糖胺和半乳糖胺偶联后，出现了新的吸收带，位于 1639 cm?1 (酰胺 I, C=O 伸缩) 和 1545 cm?1 (酰胺 II, -NH 弯曲)，以及位于 667 cm?1 对应于面外 -NH 弯曲的带，证实了 PLGA 羧基之间形成酰胺键。

讨论
通过碳二亚胺化学合成 PLGA503H–MAN 和 PLGA503H–GAL 偶联物，通过单步反应制备了糖基化聚合物，正如 FTIR 光谱 (图 2) 所示，显示了特征酰胺 I (~1639 cm?1) 和酰胺 II (~1545 cm?1) 带 [33]，以及 1H NMR 光谱在 3–4 ppm 区域显示出归属于单糖环质子的新信号 [34], [31]。这两种分析中这些信号的低强度与

结论
在本研究中，PLGA 纳米颗粒通过碳二亚胺介导的偶联成功与甘露糖胺和半乳糖胺功能化，产生了具有明确物理化学性质的稳定糖基化纳米载体，包括纳米级尺寸、窄尺寸分布、负表面电荷和高效的白藜芦醇封装。功能化未损害胶体稳定性，并产生了能够在两者下持续释放白藜芦醇的纳米颗粒。

知情同意和患者详情
已获得所有参与者或其法定代表人的书面知情同意，以参与研究和发表文章。已遵守参与者的隐私权。

人类和生物材料
本研究包括器官或组织捐献者。本研究包括人类生物材料，已获得捐献者、或其直系亲属或法定代表人的同意，用于本研究及发表文章。本研究中使用的样本并非源自处决的

伦理批准
涉及人类参与者的所有程序均按照机构研究委员会的伦理标准和《赫尔辛基宣言》进行。所有个人均自愿同意参与，并从所有参与者处获得了书面知情同意。本研究经安蒂奥基亚大学医学院伦理委员会批准 (批准号 009，2019 年 5 月 9 日)。

生成式 AI 和 AI 辅助技术使用声明
在本工作准备过程中，作者使用 AI 辅助工具以提高语言清晰度和可读性。作者根据需要审查和编辑了内容，并对已发表文章的内容承担全部责任。

竞争利益披露
作者声明他们没有竞争利益。

财务披露
安蒂奥基亚大学通过机构奖学金计划支持了这项工作。聚合物研究实验室 (LIPOL) 和细胞免疫学与免疫遗传学组 (GICIG)，安蒂奥基亚大学提供了额外支持。

数据可用性
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。

CRediT 作者贡献声明
Luis F. Giraldo?: 写作 – 审阅与编辑、监督、资金获取、形式分析、概念化。Tatiana Clavijo-Villegas?: 调查、数据整理。Karen álvarez??: 方法论、调查、形式分析。Victor Hugo Orozco: 写作 – 审阅与编辑、监督、项目管理、形式分析、概念化。Mariana Ruda-Restrepo?: 调查、数据整理。Mauricio Rojas-López??: 监督、资源、方法论、形式分析。

竞争利益声明
作者声明没有已知可能影响本文报告工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢
作者感谢 Erik Palacio 对选定插图制备的贡献。

Estefania Osorio-Mu?oz|Esneyder Ruiz|Víctor H Orozco|Karen álvarez|Mauricio Rojas-López|Mariana Ruda-Restrepo|Tatiana Clavijo-Villegas|Luis F Giraldo