转谷氨酰胺酶2通过调控长牡蛎中CgCyclinA和CgCDC45的mRNA表达介导血细胞增殖

《Comparative Immunology Reports》：A transglutaminase 2 mediates the hemocyte proliferation through regulating mRNA expressions of CgCyclinA and CgCDC45 in the oyster

　　

转谷氨酰胺酶（TGase或TG）是一个多功能酶家族，在宿主抵抗病原感染的免疫应答中发挥关键作用。本研究从太平洋长牡蛎（Crassostrea gigas）中鉴定出一种TG2（命名为CgTG2），并研究了其在响应灿烂弧菌（Vibrio splendidus）刺激时介导血细胞增殖的功能。CgTG2包含一个Transglut_N结构域和一个TGc结构域，与虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）的MyTG-like序列具有62.8%的相似性，在系统发育树中归属于无脊椎动物分支。CgTG2的mRNA转录本在多种组织中均有分布，其中在鳃和血淋巴中的表达水平较高。在三种血细胞亚群中，粒细胞中的mRNA表达水平显著高于无粒细胞和半粒细胞。CgTG2蛋白主要分布于血细胞胞质中。通过RNAi敲低CgTG2表达后，在灿烂弧菌刺激12 h时，总血细胞中EdU⁺细胞比例（为EGFP-RNAi组的0.64倍，p < 0.05）以及CgCyclinA和CgCDC45的mRNA表达水平（分别为EGFP-RNAi组的0.54倍和0.45倍，p < 0.05）均显著下降。这些结果表明，CgTG2通过调控CgCyclinA和CgCDC45的mRNA表达来介导血细胞增殖。

**论文解读：长牡蛎CgTG2通过调控CgCyclinA和CgCDC45表达介导血细胞增殖的研究**

**一、研究背景与科学问题**

转谷氨酰胺酶（Transglutaminase, TGase或TG）是一类多功能酶家族，兼具酶活性和支架功能，在宿主抵抗病原感染的免疫应答中发挥重要作用。在哺乳动物中，TG2已被证实是一种关键的细胞存活因子，参与调控上皮-间质转化、炎症反应、干细胞存活与干性维持、侵袭和迁移等多种生物学过程。TG2通过激活ERK1/2通路和β-catenin通路促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。然而，在无脊椎动物中，关于TG2调控细胞增殖的报道相对较少，其具体分子机制尚不清楚。例如，仿刺参（Apostichopus japonicus）中的AjTGase2-like已被克隆并证明参与体腔细胞自噬和免疫应答；凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）中的LvTGI和LvTGII被发现调控循环血细胞的增殖。但TG2在无脊椎动物中调控细胞增殖的详细机制仍有待阐明。

长牡蛎（Crassostrea gigas）是全球重要的水产养殖物种，在 aquatic ecosystems 和沿海经济中均扮演重要角色。然而，疾病的频繁暴发已成为制约牡蛎养殖可持续发展的主要瓶颈，因此研究其免疫防御机制对疾病防控具有重要意义。血细胞作为牡蛎主要的免疫效应细胞和宿主防御核心，在免疫应答过程中经历动态的增殖和分化。基于此，研究人员从长牡蛎中鉴定出一个TG同源物（命名为CgTG2），旨在：(1) 研究其在组织和血细胞中的表达特征；(2) 阐明其对细胞周期相关基因CgCyclinA和CgCDC45表达的调控作用；(3) 探究其调控血细胞增殖的潜在机制。该研究发表在《Comparative Immunology Reports》。

**二、主要技术方法**

研究人员从辽宁大连当地养殖场采集约两年生的太平洋长牡蛎，在15-18 °C海水中暂养两周后进行实验。主要技术方法包括：利用RT-qPCR检测CgTG2的组织分布和时序表达特征；通过SMART网站预测蛋白结构域，利用MEGA 7.0软件以邻接法（Neighbor-Joining, NJ）构建系统发育树；将CgTG2的Transglut_N结构域编码片段克隆至pET-28a载体进行原核重组表达并纯化rCgTG2蛋白，免疫小鼠制备多克隆抗体，通过Western blot验证抗体特异性；采用免疫细胞化学结合荧光显微镜观察CgTG2在血细胞中的亚细胞定位，利用流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）基于FSC和SSC图谱分选三种血细胞亚群并检测各亚群中CgTG2蛋白丰度；通过体外转录合成dsRNA进行RNA干扰（RNA interference, RNAi）实验敲低CgTG2表达，利用EdU标记结合流式细胞术检测血细胞增殖率，并通过RT-qPCR检测细胞周期相关基因CgCyclinA和CgCDC45的mRNA表达变化。

**三、研究结果**

**1. CgTG2的分子特征与系统进化关系**

CgTG2的cDNA全长开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）为2283 bp，编码761个氨基酸，GenBank登录号为CGI_10001530（LOC105334492）。CgTG2包含一个保守的Transglut_N结构域和一个TGc结构域，与其他物种TG2的相似性为38%至62.8%。系统发育分析显示，所选TG2蛋白明显分为脊椎动物和无脊椎动物两个分支，CgTG2与虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）的MyTG-like聚于无脊椎动物分支内，表明TG2在进化上高度保守。

**2. CgTG2的组织分布及灿烂弧菌刺激后的表达特征**

CgTG2的mRNA转录本分布于血细胞及所有检测的组织中，包括肝胰腺、闭壳肌、生殖腺、鳃、唇瓣和外套膜。其中在鳃中的相对表达量最高，为外套膜的31.87倍（p < 0.05），血细胞中为28.81倍（p < 0.05），唇瓣中为9.63倍（p < 0.05）。在灿烂弧菌刺激后，血细胞中CgTG2的mRNA表达水平显著升高，于12 h达到峰值（为海水注射组的4.19倍，p < 0.01），表明CgTG2参与了长牡蛎对病原感染的免疫应答。

**3. CgTG2重组蛋白表达与抗体特异性验证**

通过Ni-NTA亲和层析纯化获得分子量约35 kDa的rCgTG2蛋白（对应Transglut_N结构域）。利用该重组蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体在长牡蛎血细胞蛋白中检测到一条约95 kDa的特异性条带，与CgTG2的理论分子量一致，证实了抗体的特异性。

**4. CgTG2蛋白在血细胞中的分布特征**

流式细胞术分析显示，在无粒细胞、半粒细胞和粒细胞中，CgTG2阳性细胞（FITC⁺）的比例分别为50.60%、81.14%和88.17%。粒细胞中CgTG2蛋白丰度最高，分别为无粒细胞的1.87倍（p < 0.05）和半粒细胞的4.43倍（p < 0.05）。免疫细胞化学结果显示，CgTG2的阳性绿色荧光信号主要定位于血细胞胞质中，在三种血细胞亚群中均有分布，以粒细胞中最为丰富。鉴于粒细胞被认为是牡蛎中主要的免疫活性血细胞，具有较高的吞噬能力和免疫效应分子产生能力，CgTG2可能在粒细胞介导的固有免疫应答中发挥重要作用。

**5. RNAi敲低CgTG2对血细胞增殖的影响**

利用RNAi技术敲低CgTG2表达后，经灿烂弧菌刺激12 h，CgTG2-RNAi组牡蛎血细胞中EdU⁺细胞比例较EGFP-RNAi组显著下降（为EGFP-RNAi组的0.64倍，p < 0.05），表明CgTG2表达下调显著抑制了血细胞的增殖能力。该结果证明CgTG2在灿烂弧菌刺激下促进长牡蛎血细胞的增殖。

**6. CgTG2对CgCyclinA和CgCDC45 mRNA表达的调控**

在CgTG2 dsRNA注射后24 h，血细胞中CgTG2的mRNA表达水平显著降低至EGFP-RNAi组的0.50倍（p < 0.05），证实RNAi效率良好。在灿烂弧菌刺激后，CgTG2-RNAi组血细胞中细胞周期相关基因CgCyclinA和CgCDC45的mRNA表达水平均显著下降，分别为EGFP-RNAi组的0.54倍和0.45倍（p < 0.05）。CDC45是复制起点激活和持续性DNA复制所必需的保守蛋白，是细胞分裂周期阻滞表型的常规标志物；CyclinA1则控制肿瘤发生和卵巢癌化疗耐药中的增殖和存活活性。这些结果表明，CgTG2通过上调CgCyclinA和CgCDC45的表达来促进血细胞增殖，这一调控机制在无脊椎动物中具有一定保守性。

**四、讨论与结论**

本研究从长牡蛎中鉴定出含有Transglut_N和TGc结构域的CgTG2，其蛋白主要定位于血细胞胞质中，在粒细胞中表达水平最高。CgTG2在灿烂弧菌刺激后表达上调，RNAi敲低该基因导致血细胞中EdU⁺细胞比例显著下降，同时细胞周期调控因子CgCyclinA和CgCDC45的mRNA表达水平也显著降低。研究结论表明，CgTG2在长牡蛎中通过调控CgCyclinA和CgCDC45的mRNA表达来促进血细胞增殖，这一发现为深入理解无脊椎动物中TG介导的免疫激活和调控机制提供了重要见解。