人源多能干细胞在悬浮类器官中规模化生成T淋巴细胞

《Stem Cell Reports》：Scalable generation of T lymphocytes from human pluripotent stem cells in suspended organoids

　　

人源多能干细胞（hPSC）是用于生产T细胞以进行再生医学和免疫治疗的极具前景的细胞来源。然而，开发一种可规模化的悬浮培养体系从hPSC生成功能性T淋巴细胞仍具挑战。研究人员开发了一种基于Matrigel的人工胸腺类器官（Gel-ATO）系统，将hPSC来源的诱导造血祖细胞（iHPC）与MS5-hDLL4基质细胞共同包封。所得Gel-ATO产生了具备抗原特异性体外细胞毒性和体内肿瘤抑制功能的功能性iT细胞。在此基础上，研究人员进一步建立了旋转悬浮培养体系，相较静态悬浮培养使iT细胞产量提升近20倍。重要的是，旋转悬浮培养来源的iT细胞保留细胞因子分泌、增殖和细胞毒性功能。该工作兼顾可规模化性与功能性双重需求，为未来T细胞基于细胞的疗法临床生产奠定基础。

研究背景与立项依据

T细胞疗法在癌症与自身免疫病治疗中已显现疗效，但受限于缺乏可规模化、“现货型”（off-the-shelf）T细胞供应。人源多能干细胞（hPSC）因无限自我更新与向功能性治疗细胞分化的潜力成为理想来源。既有2D共培养、2D固定化DLL4、3D Transwell人工胸腺类器官（ATO）等平台虽能诱导αβ T细胞，但均难以适配悬浮放大生产；而iT细胞分化须持续Notch1-DLL4直接接触信号，使悬浮体系设计尤为困难。为此，研究人员旨在构建一种既能维持DLL4介导Notch激活、又兼容生物反应器级悬浮放大的水凝胶类器官平台。

主要技术方法概览

研究人员采用人化学诱导多能干细胞（hCiPSC，含hCiPSC-3、hCiPSC-2系）及转录因子重编程hiPSC-7系，分阶段诱导原始条带中胚层、动脉型造血内皮（HE）细胞至iHPC；以鼠源MS5转导人DLL4（MS5-hDLL4）为基质细胞；先后构建Matrigel基Gel-ATO、海藻酸钠基A-ATO、海藻酸钠复合VitroGel-RGD的AV-ATO，以及旋转瓶R-S-ATO体系；功能验证涵盖流式免疫表型、bulk/scRNA-seq、TCRβ CDR3测序、CFSE增殖、抗CD3/CD28/CD2扩增、体外K562靶细胞荧光素酶杀伤及NPG小鼠体内肿瘤抑制；其中抗原特异性系采用NY-ESO-1特异性1G4 TCR（慢病毒或GAPDH位点CRISPR-Cas9敲入）工程化hCiPSC。

研究结果

Generating iHPCs from human chemically induced pluripotent stem cells（hCiPSCs）

研究人员通过WNT/bFGF诱导原始条带样细胞，BMP4/VEGF/bFGF联合TGFβ抑制剂促动脉HE，再经VEGF/SB-431542/IL-7+SCF/Flt3L/TPO实现内皮-造血转化，自单hCiPSC扩约150倍获得CD34⁺ iHPC，供后续T系诱导。

Development of Gel-ATO for generating iT cells from hCiPSCs

将iHPC与MS5-hDLL4以1:5比例包埋Matrigel，35–49天递次出现CD7⁺CD5⁺早期胸腺祖细胞（ETP）、CD4⁺CD8⁺双阳（DP）及CD3⁺单阳（SP）iT细胞；1G4 TCR过表达加速CD3⁺TCRαβ⁺表面组装；与Transwell-ATO效率相当。

Assessment of T cell-associated functions in Gel-ATO-derived iT cells

第6周分选CD7⁺CD5⁺CD4⁺CD8β⁺ DP细胞，抗CD3/CD2/CD28激活后向CD8⁺SP成熟，CFSE示增殖伴CD25/4-1BB上调；1G4-iT细胞14天扩约100倍，体外特异性杀伤K562-NY-ESO-1（p=0.008），NPG小鼠体内显著抑瘤（day31 p=0.0047）。

Transcriptional analysis of iT cell differentiation kinetics in Gel-ATOs

bulk RNA-seq示TCF7/LEF1/BCL11B渐进上调、RAG1/2与PTCRA后期下调；PCA聚于胸腺DP/SP群；TCRβ CDR3长度分布与Vβ多样性近似胎儿胸腺，高度多克隆；scRNA-seq确认DP细胞具胸腺发育轨迹但未完成阳性选择，伴少量NK/固有淋巴样细胞（ILC）混杂。

Generation of iT cells in suspended Gel-ATOs

Matrigel无法成球悬浮，改用0.5%海藻酸钠A-ATO可悬浮分化但产量较Gel-ATO低10倍；加入VitroGel-RGD（AV-ATO）提升CD7⁺CD5⁺与DP得率并支持激活后扩增。

iT cells generated in a rotating suspended Gel-ATO system

AV-ATO转入60 rpm旋转瓶（R-S-ATO），T28时CD7⁺CD5⁺淋巴细胞较静态悬浮近20倍增强；450 mL体系获约3×10⁷ CD3⁺ iT细胞（约6.6×10⁴/mL），激活扩约40倍，保留CD45RA⁺CD27^±表型、PMA/离子霉素诱导IFNγ等分泌及NY-ESO-1特异性杀伤（p=0.0007）；RNA-seq提示ITGAL/ITGB2（LFA-1）、KLF2、PIEZO1等流剪应力相关基因上调。

讨论与结论翻译

研究人员认为，所建Matrigel基Gel-ATO可生具体内外功能的iT细胞；进一步以海藻酸钠+VitroGel-RGD实现悬浮AV-ATO，并以旋转瓶R-S-ATO将产量提升近20倍，且细胞保留增殖、细胞因子分泌与抗原特异性杀伤。该水凝胶3D悬浮平台同时解决Notch-DLL4接触依赖与放大生产矛盾，但当前SP成熟度不全（部分留PTCRA、具CCR7⁺亚群）、MS5鼠源基质不符无异种GMP规范，故属概念验证而非临床终端工艺；未来需以hPSC源hDLL4基质替代并优化阳性选择。总之，旋转水凝胶悬浮ATO体系为hPSC源功能性iT细胞大规模生成及癌症免疫治疗转化提供了基础。

（文载《Stem Cell Reports》）